ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Burada, sıçanlarda anestezi olmadan hızlı, güvenli ve tekrarlanan kan alımını sağlayan etkili sıçan kısıtlaması ve subklavyen ven ponksiyon yöntemlerinin bir kombinasyonunu sunuyoruz.
Abstract
Sıçanlardan tekrarlanan kan örnekleri elde etmek için birkaç yerleşik yöntem vardır, en sık kullanılan yöntemler anestezisiz lateral kuyruk ven örneklemesi ve anestezi ile juguler ven örneklemesidir. Ancak bu yöntemlerin çoğu yardım ve anestezik ekipman gerektirmekte ve bazen kan alınması veya kan örneklerinin kalitesizliği açısından zorluklar yaratmaktadır. Ek olarak, bu kan toplama yöntemleri, çok sayıda sıçan için tekrarlanan kan örneklemesi gerektiğinde önemli ölçüde zaman ve insan kaynağı tüketir. Bu çalışma, anestezi uygulanmamış sıçanlarda tek bir yetkin birey tarafından tekrarlayan kan örneklemesi için bir teknik sunmaktadır. Subklavyen venin delinmesi ile oldukça tatmin edici kan örnekleri alınabilir. Yöntem, sıçan kısıtlamasından kan alımının tamamlanmasına kadar sadece 2 dakikalık bir medyan süre ile %95'lik etkileyici bir genel başarı oranı gösterdi. Ayrıca, belirlenen aralıkta ardışık kan alımlarının yapılması sıçanlara herhangi bir zarar vermez. Bu yöntem, özellikle büyük ölçekli farmakokinetik çalışmalarda kan toplama için teşvik edilmeye değerdir.
Introduction
Sıçanlar en yaygın deney hayvanlarından biridir ve kan örnekleri almanın birçok yolu vardır. Sonuç aşamasında tek bir kan alımını içeren deneyler için, kardiyak ponksiyon veya abdominal aort kan alımı yoluyla yeterli miktarda kan elde edilebilir1. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, özellikle ilaçların emilimini, dağılımını ve metabolizmasını belirlemek için tekrarlanan kan alımının gerekli olduğu farmakokinetik ve toksikoloji çalışmalarında, rutin kan veya biyokimyasal analiz için sıçanlardan tekrarlanan kan alınmasını gerektirir2.
Şu anda, kuyruk ven kanı alımı, sıçanlardan kan örneklemesi için en yaygın yöntem olmasına rağmen, anestezi gerektirmemesine rağmen, bu yöntem tekrarlanan toplamalar için zorlayıcı olabilir ve toplanan kan hacmi nispeten küçüktür 3,4. Ek olarak, safen ve penil damarlardan kan alınabilmesine rağmen, elde edilen kan miktarı sınırlıdır ve anestezi gerekir 1,5. Ayrıca, submandibular venöz pleksusun yanı sıra dil altı, juguler ve subklavyen damarlardan toplanan kan örnekleri daha yüksek kaliteli örnekler sağlar, ancak tipik olarak anestezi veya birden fazla kişinin yardımını gerektirir 1,6,7,8,9. Son olarak, retro-orbital sinüs/kanal kan alımı sadece anestezi gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda sıçanlarda potansiyel olarak yaralanma ve strese neden olabilir9.
Tipik olarak ana damarlardan elde edilen kan örneklerinin kalitesi genellikle en yüksek standarttır1. Şu anda, bazı çalışmalar, juguler ven yoluyla sürekli mikrosampasyonun sıçanlarda toksikolojik araştırmalar için çok uygun bir yöntem olduğunu bulmuştur, ancak bu yöntem genellikle juguler ven kateterizasyonu gerektirir 10,11,12. Bu nedenle, cerrahi müdahale olmadan hayvan araştırmalarının 3R ilkesine uygun olarak yüksek kaliteli kan örneklerinin nasıl elde edileceğini araştırmaya değer. Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda subklavyen venden etkili bir şekilde kan ekstraksiyonu için bir yöntem sunmaktı. Bu teknik, anesteziye gerek kalmadan tek kişilik bir prosedürle tatmin edici örneklerin hızlı bir şekilde toplanmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun 8. baskısında belirtilen yönergelere bağlı kalmıştır13. Araştırma, Lanzhou Üniversitesi İkinci Hastanesi Etik Kurulu'ndan onay aldı ve ARRIVE yönergeleri 2.014'e uygun olarak belgelendi. 12-16 haftalık on iki sağlıklı Wistar sıçanı (290-330 g ağırlığında altı erkek ve 250-280 g ağırlığında altı dişi), gerçek deneyden 3 gün önce Lanzhou Üniversitesi GLP Hayvan Laboratuvarı'na yerleştirildi. Kullanılan sıçan kafesleri, 545 mm x 395 mm x 200 mm ölçülerinde R5 tipindeydi ve otoklavlanmış yatak malzemesi ile donatılmıştı. Tüm sıçanlara hem yiyecek hem de suya sınırsız erişim sağlandı. Laboratuvarda ortalama nem oranı %25, sıcaklık ortalama 24 °C ve gece ile gündüz arasında değişen bir ışık döngüsü (07:00/19:00) sağlandı. Çalışmanın sonunda, tüm hayvanlara aşırı dozda izofluran kullanılarak insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı. Bu çalışmada kullanılan malzeme ve araçlarla ilgili kapsamlı bilgi için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
1. Örneklem büyüklüğü hesaplaması ve hayvan seçimi
- Denklem(15) kullanarak hayvan örneklem büyüklüğünü tahmin etmek için kaynak denklem yöntemini 1 seçin.
E = Toplam hayvan sayısı − Toplam grup sayısı (1)
Burada E , varyans analizi serbestlik derecesidir (ANOVA) ve 10 ile 20 arasında değişir.
NOT: Bu çalışmada 12 hayvan A ve B olmak üzere iki gruba ayrıldı (grup başına üç erkek ve üç dişi). - Bu çalışmanın birincil sonucunu, tek bir kişi tarafından tekrarlanan kan örneklemesinin başarı oranı ve zaman tüketimi olarak tanımlayın.
- İkincil sonuç ölçütlerini, sıçan vücut ağırlığı, yiyecek ve su alımındaki değişikliklerin yanı sıra advers olayların (klavikula kırıkları, deri altı hematomlar, pnömotoraks ve mortalite gibi) insidansı olarak tanımlayın.
- Başarılı kan örneklemesini aşağıdaki kriterleri karşılayacak şekilde tanımlayın: i) tek bir kan alımı için üçten az delinme; ii) 5 dakikayı geçmeyen toplam süre (sıçan kısıtlamasından kan alımının tamamlanmasına kadar); ve iii) berrak plazma elde ederken hedeflenen kan hacmine ulaşmak. Bu kriterlerden herhangi bir sapmayı örnekleme hatası olarak kabul edin.
2. Hayvan kısıtlama ve kan alma
NOT: A ve B grubu sıçanlardan alınan kan örnekleri, her ikisi de en az 100 kan örneği almış olan iki deneyimli araştırmacı tarafından toplanmıştır. Her iki sıçan grubundan 4 gün boyunca toplam 96 kez kan örnekleri toplandı. Bu kan alma yöntemi, sıçanlar için anestezi veya ek kısıtlama cihazları gerektirmez. Ancak, usta kullanım teknikleri gerektirir.
- Kan örneklemesinden önceki gün (1. gün) sabah saat 8:00'de, yiyecek ve suyu tartılırken her sıçanı kendi kafesine atayın. Daha sonra, ölçümlere kör olan başka bir araştırmacıya, farelerin ağırlığını, yiyecek tüketimini ve su alımını 1. günden itibaren her gün saat 8: 00'de kaydedin.
- Bu protokolü takip etmek için, önce her gün saat 10:00'da ve daha sonra saat 10:00'da kan alın, her iki taraftaki subklavyen damarlardan dönüşümlü olarak 0.15 mL kan alın.
NOT: Toplanacak kan miktarı, en düşük ağırlıktaki sıçanın bir hafta içinde tolere edebileceği maksimum hacme göre belirlendi. - Bir şırıngayı sodyum heparin (25 U/mL) ile yıkayın ve enjeksiyon bölgesini alkolle dezenfekte edin.
- Sıçanın sırt derisini nazikçe okşayın ve sıçanın rahatlamasına yardımcı olmak için boynunu tekrar tekrar sıkıştırın (Video 1).
- Baskın olmayan elin başparmağını ve işaret parmağını kullanarak, sıçanın boyun derisini sıkıca kavrayın ve kaldırın (Şekil 1A ve Video 1).
- Baskın elin koordinasyonuyla, sıçanın arka derisini sabitlemek ve ön uzuvlarını hareketsiz hale getirmek için baskın olmayan elin kalan üç parmağını ve avuç içini kullanın (Şekil 1B, C ve Video 2).
NOT: Sıçan direnir veya mücadele ederse, sıçanın kullanıma alışmasına yardımcı olmak için bu prosedür birkaç kez tekrarlanabilir. Aşağıdaki adımlar başarılı kan alımının anahtarıdır. - Baskın olmayan elin işaret parmağını kullanarak, farenin kafa derisini hafifçe aşağı doğru bastırın, diğer parmaklar avuç içi ile birlikte omuz eklemini dışa doğru döndürmeye yardımcı olur. Bu işlem sırasında, sıçanın omuz eklemini tamamen uzatmak için baskın elinizi kullanın (Şekil 1D-F ve Video 2).
- Sıçanın başını ve vücudunu düz bir çizgide hizalamak için baskın olmayan elinizle sıçanı sıkıca kavrayın (Şekil 1G,H). Ardından, klavikulanın konumunu bulmak ve delinme bölgesini doğrulamak için baskın elinizi kullanın (Şekil 1I, Video 2 ve Video 3).
NOT: Fareyi tıraş etmek gerekli değildir. Şekil 1'de tıraşlama sadece köprücük kemiği ve ponksiyon pozisyonunu daha büyük ölçüde göstermek için yapılmıştır. Sıçanları, özellikle sıçanları >350 g kısıtlarken, sıçanın ayaklarını sağlam bir yüzeye koymasına izin vermek, vücut ağırlığını desteklemeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, kısıtlayıcı, kısıtlamanın solunum sıkıntısına neden olabilecek çok sıkı olmadığından emin olmak için kan toplarken her sıçanın solunum hızını izlemelidir. - Şırıngayı baskın elde sıçanın vücuduna paralel tutarak, iğne ucu yukarı bakacak ve şırınga ölçeği deneyciye doğru bakacak şekilde, sıçanın vücudunun orta hattı ile yaklaşık 15°'lik bir açı sağlayın. İğneyi klavikula çentiğinin 0,5 cm altına (klavikula proksimal üçte birlik kısmının ve sternumun birleştiği yere) sokarak iğnenin sıçanın vücuduna paralel kalmasını sağlayın (Şekil 1J ve Video 3).
NOT: Kan damarını delmekten veya bitişik damarlarda yanlışlıkla hasara neden olmaktan kaçınmak için iğne batırma açısına ve derinliğine özellikle dikkat edilmelidir. - Negatif bir basınç oluşturmak için şırıngayı hafifçe geri çekin, genellikle kan damarına girdikten sonra elle tutulur bir atılım hissi eşlik eder (özellikle ilk kan toplama sırasında belirgindir). Bu pozisyonu koruyun ve gerektiğinde sabit bir hızda 0.1-1.0 mL kan toplayın (haftada yaklaşık 4-5.3 mL/kg kanIACUC yönergelerini izleyerek 1) (Şekil 1K ve Video 3).
- Delindikten sonra kan yoksa, iğnenin açısını ve derinliğini nazikçe ayarlamayı deneyin veya şırıngayı hafifçe döndürün (Video 3). Aynı tarafta art arda üç deneme başarısız olursa, tüm kanamayı durdurun ve ardından delinme için karşı tarafa geçin.
NOT: Sıçanın rahatsızlıktan dolayı mücadele etmesini önlemek için deriden hızlı bir şekilde delinmesi tavsiye edilir. - Hemostaz için pamuklu çubuk uygulayın ve fareyi kafesine geri koyun (Video 4).
- Kan örneklerini deneysel gereksinimlere göre işleyin.
3. Kan örneği işleme
- Şırınga iğnesini keskin bir kaba atın. Toplanan kanı daha önce heparin ile durulanmış 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 4 °C ve 1.200 x g'ye ayarlayarak bir santrifüje yerleştirin ve plazmayı ayırmak için 10 dakika santrifüjleyin. Serumu 1.0 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanarak temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Basınca bağlı hemolizi önlemek için gerektiğinde iğne ucunu çıkarın. Plazma aspirasyonu sırasında, tüpün dibinden kan hücreleri çekmekten kaçının. Bazen, şırınganın yüzeyi sıçan kürkü toplayabilir; Pıhtılaşmaya neden olabileceğinden tüpe herhangi bir kürk girmemesine dikkat edin.
4. İstatistiksel analiz
- Tüm verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun ve varyansın homojenliği için test edin.
- Gruplar arasındaki başarı oranlarını karşılaştırmak için Fisher'ın kesin testini kullanın.
- İki grup arasındaki genel ortalamaları karşılaştırmak için iki örneklemden bağımsız bir t-testi kullanın.
- Kan örnekleme süresi, vücut ağırlığı, gıda alımı ve su tüketimi gibi sürekli ölçümler için varyans analizini (ANOVA) kullanın. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı kabul edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yüksek kaliteli plazma örnekleri, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, herhangi bir kırmızı renk tonu veya pıhtılaşma olmadan soluk sarı bir renk tonu, berraklık ve şeffaflık sergiler. Şekil 2B'de sırasıyla yanlış işlemler sonucu hemoliz (sol taraf) veya pıhtılaşma (sağ taraf) görülmektedir. 4 gün içinde 96 kan alma seansı boyunca, A ve B grupları için ortalama tek kan alma süreleri sırasıyla 119.87 ± 33.62 s ve 123.28 ± 30.96 s idi. İki grup arasında günlük olarak kan alma süreleri açısından anlamlı fark yoktu (t =0.66, P =0.54, Tablo 1). En kısa bireysel kan alma süreleri sırasıyla 78 s ve 89 s idi.
Başarılı bir tek kan alımı için gereken ortalama deneme sayısı A ve B grupları için sırasıyla 1.21 ve 1.17 idi. İki grup arasında deneme sayısı açısından anlamlı fark yoktu (t=0.58, P=0.60, Tablo 2). Genel başarı oranları A ve B grupları için sırasıyla %93.8 (45/48) ve %95.8 (46/48) idi ve iki grup arasında genel başarı oranlarında anlamlı bir fark yoktu (P > 0.05, Tablo 1). Grup B'de her zaman noktasında kan alma zamanı açısından anlamlı bir fark yoktu. Grup A'da ikinci günkü kan alma süresi dördüncü güne göre daha azdı (105.75 ± 14.22s'ye karşı 144.5 ± 25.45 s, t = 12.39, P < 0.01; Tablo 1) 'dir. Ek olarak, daha fazla deneme ve daha uzun delme süreleri genellikle daha yüksek başarısızlık oranlarını gösterir (Şekil 3A-C). Üçüncü gün, Grup B hemolize atfedilen bir başarısızlıkla karşılaştı. Dördüncü günde, Grup A üç başarısızlıkla karşılaştı: biri hemoliz ve diğer ikisi kan örneği alamama nedeniyle. Grup B ayrıca kan örneği alınamaması nedeniyle bir başarısızlık yaşadı.
Art arda 4 günlük gözlem boyunca, her iki sıçan grubu da sürekli kilo alımı gösterdi. Su ve yiyecek alımı, aynı cinsiyetteki sıçanlar arasında nispeten sabit kalmıştır. Tüm kan alma süreci boyunca, sıçan mortalitesi vakası yoktu ve klavikula kırıkları, pnömotoraks veya delinme bölgesi hematomları gibi önemli komplikasyonlar gözlenmedi (Şekil 3D-F ve Tablo 3).
Şekil 1: Sıçanlarda subklavyen venin fiksasyonu ve kan alma yöntemleri. (AH) Fiksasyonun manipülasyonu; (I) köprücük kemiği ve kan alma yerinin yeri; (JL) kan alma ve hemostaz süreci. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Başarılı ve başarısız bir şekilde toplanan kan örnekleri. (A) Tipik kan örnekleri ve izole plazma; (B) hemolize (solda) ve pıhtılaşmış (sağda) kan örnekleri Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kan alımının etkinliğinin ve güvenliğinin değerlendirilmesi. (A) Günlük ortalama kan alma süresi; (B) günlük ortalama delinme sayısı; (C) Her iki grupta kan alımının başarı ve başarısızlık oranları; (D-F) her iki sıçan grubunda da kan alma sırasında vücut ağırlığı, gıda alımı ve su alımındaki değişiklikler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sıçan boynu damarlarının anatomisi. (A) Yüzeysel anatomik yapılar; (B) derin anatomik yapılar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Grup | Saat | Ortalama kan alma süresi (ler) | |||
| 1. Gün | 2. Gün* | 3. Gün | 4. Gün | ||
| A | Saat 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117.83 ± 12.02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 10,86 ± 108,67 | 111.00 ± 6.95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Ortalama süre | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144.5 ± 25.45 | |
| Başarı oranı | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Genel başarı oranı | 93.8% (45/48) | ||||
| Genel ortalama süre | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | Saat 10:00 | 98,17 ± 7,24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147.2 ± 17.47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Ortalama süre | 102.08 ± 12.02 | 118,42 ± 17,82 | 123.92 ± 25.16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Başarı oranı | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Genel başarı oranı | 95.8% (46/48) | ||||
| Genel ortalama süre | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tablo 1: İki sıçan grubunun kan alma süreleri ve başarı oranları. * A grubunda ikinci günün kan alma zamanı dördüncü güne göre daha azdı (t = 12.39 P < 0.01).
| Grup | Saat | Ortalama delinme sayısı | |||
| 1. Gün | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | ||
| A | Saat 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Ortalama | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Genel ortalama | 1.21 | ||||
| B | Saat 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Ortalama | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Genel ortalama | 1.17 | ||||
Tablo 2: Sıçanlarda kan alımı için ortalama delinme sayısı.
| Cinsiyet | Grup | Ağırlık (g) | Gıda alımı (g) | Su alımı (g) | |||||||||
| 1. Gün | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | 1. Gün | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | 1. Gün | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | ||
| ♀ | A | 260 ± 7,5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.3 ± 0.79 | 13.5 ± 0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.0 ± 0.77 | 23,9 ± 0,36 | 23.1 ± 0.77 | 24,4 ± 0,70 | 24.6 ± 0.12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7.0 | 14.4 ± 0.45 | 13.9 ± 0.52 | 14,7 ± 0,26 | 14.3 ± 0.56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24.1 ± 1.79 | |
| T / Q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Düzeltilmiş P Değeri | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | A | 313.7 ± 12.0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15.9 ± 0.64 | 16.2 ± 0.08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26.2 ± 0.62 | 27.2 ± 0.9 | 26.9 ± 1.0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16.9 | 15.3 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 15.1 ± 0.33 | 15.3 ± 0.86 | 27.1 ± 0.37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26.2 ± 0.99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Düzeltilmiş P Değeri | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tablo 3: Sıçanların günlük vücut ağırlığı, gıda alımı ve su alımındaki değişiklikler.
Video 1: Sıçanların sakinleştirilmesi ve ele alınması. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Sıçanlar için kısıtlama prosedürleri. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Sıçanlar için kan alma prosedürü. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 4: Delinme bölgesinde hemostatik kompresyon. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kuyruk damarı kan alımı, sıçanlarda tekrarlanan kan örneklemesi için en yaygın yöntem olmasına rağmen, anestezi ilaçlarından etkilenebilir ve kuyruk damarının küçük boyutu nedeniyle, tek bir örnekte toplanabilecek kan miktarı sınırlıdır ve bu da daha uzun bir kan alma süresine yol açar 4,5. Sıçan kuyruğu damarlarının kılcal mikrosampasyonu (CMS) ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) -tandem kütle spektrometresi (MS/MS) sistemleri, sıçanlarda kullanılan kan miktarını azaltabilse de,11, tüm kurumlar bu pahalı ekipmanla donatılmamıştır. Retrobulbar pleksus/sinüsten kan örneklemesi genellikle sıçanlarda endişe ve ağrıya neden olur ve yanlış kullanım sıçanların görüşüne ve sağlığına bile zarar verebilir. Bu nedenle, sıçanlarda kan örneklemesi için bu yöntem önerilmez9.
Subklavyen ven, pektoralis majör ile sıçanın deltoid kası arasında yer alır ve internal klavikulanın üçte birinde juguler ven içine drene olur (Şekil 4). Yang ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada, anestezi altındaki sıçanlarda subklavyen venden kan alımının başarı oranı, ponksiyonun başlangıcından sonuna kadar minimum süre 65 s7 olan yetenekli bir operatör tarafından yaklaşık% 90 idi. Wang ve arkadaşlarının çalışmasında, sıçan subklavyen veninden dikey bir yaklaşım kullanılarak kan örnekleri toplandı. Yöntemleri anestezi içermese de, sıçan6'yı güvenli bir şekilde kısıtlamak için iki kişinin işbirliğini gerektiriyordu. Bu çalışma protokolü kan alımının iyi bir avantajını göstermektedir. Bu protokol herhangi bir özel kısıtlama cihazı veya anestezi tesisi gerektirmez. Doğru kullanımla, sıçanlar genellikle minimum direnç gösterir. Sıçan kısıtlamasından kan alımının tamamlanmasına kadar geçen ortalama süre sadece 2 dakikaydı ve %95'lik etkileyici bir genel başarı oranı elde edildi. Bu yöntem, insan kaynaklarını önemli ölçüde korur ve kan alma için gereken süreyi azaltır. Ayrıca, elde edilen plazma örnekleri berrak ve şeffaftır, minimum hemoliz ve pıhtılaşma olayları meydana gelir, böylece deney tekrarını en aza indirir. Bu teknikteki yeterlilik, tekrarlayan kan alımı gerektiren büyük ölçekli sıçan farmakokinetiği ve toksikoloji deneylerini yönetmek için özellikle değerlidir.
Çalışmamızda, kan alma başarısızlığının ana oluşumu 4. gündeydi ve bu, tekrarlanan ponksiyonların neden olduğu venöz hasarla ilişkili olabilir. Tekrarlanan ponksiyonlar damar duvarında hasara yol açabilir ve enflamatuar bir yanıta neden olarak damar duvarının kalınlaşmasına ve sertleşmesine ve hatta damar daralmasına neden olabilir. Delinmeden sonra hemostaz yetersizse, ekstravaze kan ayrıca doku ödemine ve iltihaplanmaya neden olabilir ve daha sonra skar dokusu oluşumuna yol açabilir. Bu yara dokularının nüfuz etmesi zordur ve ayrıca kan damarlarının pozisyonunu değiştirmesine neden olabilir, bu da kan damarlarının bulunmasını ve delinmesini zorlaştırır. Çalışmamızda, kan toplama için 26G'lık bir şırınga (0.45mm) kullanıldı, bu da insan damarlarına göre iyidir, ancak yine de sıçan damarlarında önemli hasara neden olur. Bu, ilk kan alımı sırasında iğne damardan geçtiğinde, kan alma sayısı arttıkça azalan, daha uzun kan alma süreleri ve daha yüksek başarısızlık oranları ile net penetrasyon hissi ile kanıtlanmıştır. Bu nedenle, kan alımı için daha ince bir insülin iğnesi kullanılmasını öneriyoruz ve kan alımından sonra hematom oluşumunu önlemek için yeterli basınç uygulanmalı ve yeterli venöz onarımı sağlamak için alternatif kan alımları yapılmalıdır. Deneyimlerimize göre, iyi eğitimli bir flebotomist, her kan alımı arasında ortalama 2-3 saat aralıkla, 24 saat içinde 8-10 kez aynı sıçanın bilateral subklavyen damarlarından dönüşümlü olarak kan almak için 26G'lik bir iğne kullanabilir. Bununla birlikte, bir sıçanın tolere edebileceği maksimum kan alımı sayısı, iyileşme süresi ve kan alma döngüsü, kullanılan iğne ölçerden, farklı deneylerin gerektirdiği kan alma aralıklarından ve flebotomistin yeterliliğinden etkilenebilir. Bu faktörlerin gelecekteki araştırmalarda daha fazla araştırılması gerekmektedir. Farmakokinetik deneyler için gerekli olan yoğun kan örneklemesi için, sol ve sağ subklavyen damarlardan dönüşümlü olarak kan almak daha iyidir. Gerçekten kullanılamadığı durumlarda, diğer kan alma yöntemleri tamamlanabilir.
Vücut ağırlığı, su tüketimi ve gıda alımı, sıçanların sağlık durumunu değerlendirmek için en temel ve anlaşılır göstergelerdir16. Erken bir çalışma, juguler ven yoluyla günde 0.9 mL'den daha az kan alımının sıçanların hemodinamiğini etkilemediğini ve önemli bir kilo kaybına neden olmadığını göstermiştir. Bununla birlikte, kan alımı 1,5 mL'yi aştığında kilo kaybına neden olabilir17. Yokoya ve ark. tarafından yapılan çalışmada, juguler venden tekrarlanan mikro örnekleme (her seferinde 50 μL, 24 saat içinde 6-7x) sıçan vücut ağırlığını veya gıda alımını etkilememiştir10. Ek olarak, kan alma şekli vücut ağırlığını ve sıçanların gıda alımını etkileyebilir. Dil altı ven kanı alımını kullanan önceki bir çalışmada, ilk gün 24 saatlik 0.5-1.0 mL kan toplanması, kilo kaybı önemli olmasa da, sıçan vücut ağırlığında bir azalmaya ve gıda alımında azalmaya neden oldu18. Bu çalışmada, sıçanların vücut ağırlığının kan alma döneminde hala istikrarlı bir şekilde arttığı ve sıçanların gıda ve su alımında, kan alımına bağlı komplikasyonlarda ve sıçanların ölümünde önemli bir değişiklik olmadığı, bu yöntemin güvenli ve güvenilir olduğunu göstermektedir.
Kan alma işlemini gerçekleştirmeden önce sıçanları kısıtlama sürecine alıştırmanın, sıçanlardaki stresi azaltacağını ve kan alımının başarı oranını artıracağını vurgulamak çok önemlidir. Yetersiz fiksasyon ve yetersiz damar maruziyeti, kan alma başarısızlıklarına yol açabilir ve hatta sıçanların acı içinde mücadele etmesi nedeniyle lokal damar yırtılmasına neden olabilir. Daha hafif vakalarda bu, gözle görülür deri altı hematomlara neden olabilirken, ciddi vakalarda sıçan ölümlerine yol açabilir. Ayrıca, zayıf fiksasyon, sıçanların kaçmasına ve bireylere zarar vermesine neden olabilir. Bu nedenle, kan alma prosedürüne geçmeden önce kullanım tekniğine iyice hakim olmanızı şiddetle tavsiye ederiz. Ayrıca, aşırı basınç sıçanlarda klavikula kırıklarına yol açabileceğinden, omuz eklemini dışa doğru döndürmek için uygulanan kuvvete karşı dikkatli olmak önemlidir.
Bu çalışmanın bir sınırlaması, sıçanlarda bu kan alma yönteminin neden olduğu stres değişikliklerini, kortikosteron seviyesindeki değişiklikleri ölçerek veya gelecekteki araştırmalarda araştırılması gereken kafes tarafı izleme yoluyla sistematik olarak değerlendirmemiş olmamızdır. Bu makalenin bir diğer sınırlılığı da kontrol olarak alternatif kan alma yöntemlerinin bulunmamasıdır. Avantajları ve dezavantajları açısından diğer kan alma yöntemleriyle karşılaştırmalar gelecekteki araştırmalarda ele alınacaktır. Toplamda, bu çalışma, anesteziye ihtiyaç duymadan sıçanlardan tek kişilik kan alımı için bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, sıçanlardan kan örnekleri almanın basit, hızlı ve güvenli bir yolunu sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Lanzhou Üniversitesi İkinci Hastanesi'nin Cuiying Plan Projesi tarafından desteklenmiştir (Hibe No. PR0121015) ve Gansu İl Üriner Sistem Hastalıkları Araştırma Anahtar Laboratuvarı (Hibe No. 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
JoVE'de Bu Ay Sayı 201 Sıçan subklavyen ven kan örneklemesiErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
