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Summary
ここでは、麻酔なしでラットの迅速、安全、反復採血を可能にする効果的なラット制限法と鎖骨下静脈穿刺法の組み合わせを紹介します。
Abstract
ラットから繰り返し血液サンプルを取得するための確立された方法はいくつかあり、最も一般的に採用されている方法は、麻酔なしの側尾静脈サンプリングと麻酔による頸静脈サンプリングです。しかし、これらの方法のほとんどは、補助具や麻酔器具を必要とし、採血や血液サンプルの質の悪さという点で困難を伴うことがあります。さらに、これらの採血方法は、多数のラットに対して採血を繰り返す必要がある場合、多大な時間と人的資源を消費します。この研究は、麻酔をかけていないラットで、熟練した 1 人の個人で繰り返し採血する技術を提示します。鎖骨下静脈に穴を開けることで、非常に満足のいく血液サンプルを得ることができます。この方法は、ラットの拘束から採血完了までの時間の中央値で、95%という驚異的な全体的な成功率を示しました。また、指定範囲内で連続採血を行っても、ラットに害を及ぼすことはありません。この方法は、特に大規模な薬物動態研究において、採血のために推進する価値があります。
Introduction
ラットは最も一般的な実験動物の1つであり、血液サンプルを取得する方法はたくさんあります。最終段階での1回の採血を含む実験では、心臓穿刺または腹部大動脈採血によって十分な量の血液を得ることができます1。ただし、一部の研究では、特に薬物動態および毒物学の研究において、薬物の吸収、分布、および代謝を決定するために繰り返し採血する必要がある、定期的な血液分析または生化学的分析のためにラットからの繰り返しの採血が必要です2。
現在、ラットからの採血には尾静脈採血が最も一般的な方法であるが、麻酔を必要としないにもかかわらず、この方法は繰り返し採取が困難な場合があり、採取される血液の量は比較的少ない3,4。また、伏在静脈や陰茎静脈から採血はできるが、得られる血液の量は限られており、麻酔が必要である1,5。さらに、顎下静脈神経叢、舌下静脈、頸静脈、鎖骨下静脈から採取された血液サンプルは、より高品質のサンプルを提供しますが、通常、麻酔または複数の個人の支援が必要です1,6,7,8,9。最後に、眼窩後洞/運河採血は麻酔を必要とするだけでなく、ラットに傷害やストレスを与える可能性もある9。
通常、主要な静脈から得られる血液サンプルの品質は、一般的に最高水準です1。現在、いくつかの研究では、頸静脈を通る連続マイクロサンプリングがラットの毒物学的研究に非常に適した方法であることがわかりましたが、この方法は通常、頸静脈カテーテル検査を必要とします10,11,12。したがって、外科的介入なしに動物研究の3R原則に従って高品質の血液サンプルを取得する方法を探求する価値があります。本研究の目的は、ラットの鎖骨下静脈から効率的に血液を抽出する方法を提示することである。この技術により、麻酔を必要とせずに1人で満足のいくサンプルを迅速に採取することができます。
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Protocol
この研究は、実験動物のケアと使用のためのガイドの第8版で概説されているガイドラインを順守しています13。この研究は、蘭州大学第二病院の倫理委員会から承認を受け、ARRIVEガイドライン2.014に準拠して文書化されました。生後12〜16週齢の健康なWistarラット12匹(体重290〜330gの雄6匹と体重250〜280gの雌6匹)を、実際の実験の3日前に蘭州大学のGLP動物研究所に収容しました。使用したラットケージは、545mm×395mm×200mmのR5型で、オートクレーブ処理された寝具が備え付けられていました。すべてのラットには、餌と水の両方への無制限のアクセスが与えられました。実験室は平均湿度25%、平均気温24°C、昼と夜を交互に繰り返す光のサイクル(午前7:00/午後7:00)を維持しました。研究の結論として、すべての動物はイソフルランの過剰摂取を使用して人道的に安楽死させられました。この研究で使用した材料と機器に関する包括的な情報については、 材料表を参照してください。
1. サンプルサイズの計算と動物の選択
- リソース方程式法15 を選択し、式(1)を使用して動物サンプルサイズを推定します。
E = 動物の総数 − グループの総数 (1)
ここで 、E は分散分析の自由度(ANOVA)で、範囲は10から20です。
注:この研究では、12匹の動物を2つのグループ A と B に分けました(グループごとに3匹のオスと3匹のメス)。 - この研究の主な結果は、1 人の個人による反復採血の成功率と時間消費として定義します。
- 副次的評価項目を、ラットの体重、食物および水の摂取量、ならびに有害事象(鎖骨骨折、皮下血腫、気胸、死亡率など)の発生率の変化として定義する。
- 採血の成功を次の基準を満たすものとして定義します:i)1回の採血で3回未満の穿刺。ii)合計時間(ラットの拘束から採血の完了まで)が5分を超えない。iii)透明な血漿を得ながら目標とする血液量を達成する。これらの基準からの逸脱は、サンプリングの失敗と見なします。
2.動物の拘束と採血
注:グループ A および B ラットの血液サンプルは、少なくとも100個の血液サンプルを採取した2人の経験豊富な研究者によって収集されました。血液サンプルは、4日間にわたって合計96回、両方のグループのラットから収集されました。この採血方法は、ラットに麻酔や追加の拘束装置を必要としません。ただし、熟練した取り扱い技術が必要です。
- 採血前日(1日目)の午前8:00に、餌と水の重さを量る間、各ラットを個別のケージに割り当てます。次に、測定値を知らされていない別の研究者に、ラットの体重、食物消費量、および水分摂取量を1日目以降毎日午前8:00に記録してもらいます。
- このプロトコルに従うには、まず毎日午前10:00に採血し、次に午後10:00に採血し、両側の鎖骨下静脈から交互に0.15 mLの血液を採取します。
注:採血する血液の量は、最低体重のラットが1週間以内に耐えられる最大量によって決定されました。 - シリンジをヘパリンナトリウム(25 U/mL)で洗浄し、注射部位をアルコールで消毒します。
- ネズミの背中の皮膚を優しく撫でたり、首を繰り返しつまんだりして、ネズミがリラックスできるようにします(ビデオ1)。
- 利き手ではない方の手の親指と人差し指を使って、ラットの首の皮膚をしっかりとつかみ、持ち上げます(図1A および ビデオ1)。
- 利き手からの協調で、利き手でない方の手の残りの3本の指と手のひらを使ってラットの背中の皮膚を固定し、前肢を固定します(図1B、C、ビデオ2)。
注意: ネズミが抵抗したり、もがいたりする場合は、この手順を数回繰り返して、ネズミが取り扱いに慣れるのを助けることができます。採血を成功させるには、次の手順が重要です。 - 利き手ではない方の手の人差し指を使って、ラットの頭の皮膚をそっと押し下げ、他の指と手のひらで肩関節を外側に回転させます。この間、利き手を使ってラットの肩関節を完全に伸ばします(図1D-Fおよびビデオ2)。
- 利き手ではない方の手でラットをしっかりと握り、ラットの頭と体を一直線に揃えます(図1G、H)。次に、利き手を使用して鎖骨の位置を特定し、穿刺部位を確認します(図1I、 ビデオ2、 およびビデオ3)。
注:ラットを剃る必要はありません。 図1では、鎖骨と穿刺位置をより大きく見せるためだけにシェービングを行いました。ラット、特にラット>350gを拘束する場合、ラットを固い表面に足を乗せると、体重を支えるのに役立ちます。さらに、拘束具は、血液を採取しながら各ラットの呼吸数を監視して、拘束がきつすぎて呼吸困難を引き起こしないようにする必要があります。. - 利き手で注射器をラットの体と平行に持ち、針先を上向きにし、注射器の目盛りを実験者に向け、ラットの体の正中線に対して約15°の角度を維持します。鎖骨の切り欠きの0.5cm下(鎖骨と胸骨の近位3分の1の接合部)に針を挿入し、針がラットの体と平行になるようにします(図1J および ビデオ3)。
注意: 血管に穴を開けたり、隣接する血管に不注意で損傷を与えたりしないように、針の挿入角度と深さに特に注意を払う必要があります。 - シリンジを静かに少し引いて陰圧を作り、多くの場合、血管に入ったときに突破口の触知的な感覚を伴います(特に最初の採血中に顕著です)。.この位置を維持し、必要に応じて一定の速度で0.1〜1.0 mLの血液を採取します(1週間あたり約4〜5.3 mL / kgの血液1のIACUCガイドラインに従います)(図1K および ビデオ3)。
- 穿刺時に血液がない場合は、針の角度と深さを静かに調整するか、シリンジを静かに回転させてみてください(ビデオ3)。同じ側で3回連続して試みても失敗した場合は、すべての出血を止めてから、反対側に切り替えて穿刺します。
注:ラットが不快感のために苦労するのを防ぐために、皮膚を素早く穿刺することをお勧めします。 - 止血のために綿棒を塗布し、ラットをケージに戻します(ビデオ4)。
- 実験要件に従って血液サンプルを処理します。
3.血液サンプル処理
- シリンジ針は鋭利な容器に廃棄します。.採取した血液を、ヘパリンで洗い流した1.5 mLの微量遠心チューブに移します。チューブを遠心分離機に入れ、4°C、1,200 x gに設定し、10分間遠心分離してプラズマを分離します。1.0 mLのパスツールピペットを使用して血清を清潔な微量遠心チューブに移し、-80°Cで保存します。
注意: 圧力による溶血を防ぐため、必要に応じて針先を取り外してください。血漿吸引中は、チューブの底から血球を採取しないでください。時折、注射器の表面にネズミの毛皮が集まることがあります。毛皮がチューブに入らないように注意してください。
4. 統計解析
- すべてのデータを平均±標準偏差として提示し、分散の均一性を検定します。
- フィッシャーの正確確率検定を使用して、グループ間の成功率を比較します。
- 2標本の独立した t検定を使用して、2つのグループ間の全体の平均を比較します。
- 分散分析(ANOVA)を使用して、採血時間、体重、食物摂取量、水消費量などの連続測定を行います。 P < 0.05 を統計的に有意であると考えてください。
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Representative Results
高品質のプラズマ試料は、 図2Aに示すように、淡黄色の色相、透明度、透明度を示し、赤みを帯びたり凝固したりすることはありません。 図2B は、不適切な処置の結果としての溶血(左側)または凝固(右側)をそれぞれ示しています。4日間に96回の採血セッションを行った場合、グループ A と B の平均採血時間は、それぞれ119.87±33.62秒、123.28±30.96秒でした。2群間の日次採血時間に有意差はなかった(t = 0.66、 P = 0.54、 表1)。最短の個人採血時間は、それぞれ78秒と89秒でした。.
1回の採血を成功させるのに必要な平均試行回数は、グループAで1.21回、Bグループで1.17回であった。2群間で試行回数に有意差はなかった(t = 0.58、P = 0.60、表2)。全体的な成功率は、グループAとBでそれぞれ93.8%(45/48)と95.8%(46/48)であり、2つのグループ間で全体的な成功率に有意差はありませんでした(P > 0.05、表1)。各時点でのグループBの採血時間に有意差はありませんでした。グループAでは、2日目の採血時間は4日目の採血時間よりも短かった(105.75 ± 14.22秒 vs 144.5 ± 25.45秒、t = 12.39、P < 0.01;表1)です。 さらに、試行回数が多く、穿刺時間が長いほど、故障率が高くなることがよくあります(図3A-C)。3日目、グループBは溶血に起因する1つの失敗に遭遇しました。4日目、グループAは3つの失敗に遭遇しました:1つは溶血によるもので、他の2つは血液サンプルを採取できないことによるものです。また、B群では、血液サンプルを採取できなかったために1件の失敗を経験しました。
4日間連続の観察で、両群のラットは着実な体重増加を示した。水と食物の摂取量は、同性のラットの間で比較的一定に保たれました。採血プロセス全体を通して、ラットの死亡率の事例はなく、鎖骨骨折、気胸、穿刺部位血腫などの重大な合併症は観察されませんでした(図3D-Fおよび表3)。
図1:ラットの鎖骨下静脈の固定と採血方法。 (A-H)固定の操作;(i)鎖骨と採血場所の位置。(J-L)採血と止血のプロセス。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:採血に成功した血液サンプルと失敗した血液サンプル。 (A)典型的な血液サンプルおよび単離された血漿。(B)溶血(左)と凝固(右)の血液サンプル この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:採血の有効性と安全性の評価。 (A)1日あたりの平均採血時間。(B)1日あたりの平均穿刺回数。(C)両群における採血の成功率と失敗率。(D-F)ラットの両群における採血中の体重、食物摂取量、および水分摂取量の変化。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ラット頸部血管の解剖学。 (A)表面的な解剖学的構造。(B)深い解剖学的構造。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 群 | 時間 | 平均採血時間(秒) | |||
| 1日目 | 2日目* | 3日目 | 4日目 | ||
| ある | 10:00 午前 | 92.83 ± 7.38 | 100.5±17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146.6±24.76 |
| 午後10:00 | 108.67 ± 10.86 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| 平均時間 | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144.5 ± 25.45 | |
| 成功率 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| 全体的な成功率 | 93.8% (45/48) | ||||
| 全体の平均時間 | 119.87 ± 33.62 | ||||
| B | 10:00 午前 | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123.67 ± 30.99 | 147.2 ± 17.47 |
| 午後10:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17±17.50 | 165.67 ± 49.70 | |
| 平均時間 | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| 成功率 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| 全体的な成功率 | 95.8% (46/48) | ||||
| 全体の平均時間 | 123.28 ± 30.96 | ||||
表1:ラットの2つのグループの採血時間と成功率。 ※A群では2日目の採血時間が4日目より短かった(t=12.39P<0.01 )。
| 群 | 時間 | 平均穿刺回数 | |||
| 1日目 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | ||
| ある | 10:00 午前 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 午後10:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| 平均 | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| 全体平均 | 1.21 | ||||
| B | 10:00 午前 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 午後10:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| 平均 | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| 全体平均 | 1.17 | ||||
表2:ラットの採血の平均穿刺回数。
| ジェンダー | 群 | 重量(g) | 食物摂取量(g) | 取水量(g) | |||||||||
| 1日目 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | 1日目 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | 1日目 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | ||
| ♀ | ある | 260±7.5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.3 ± 0.79 | 13.5±0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.0 ± 0.77 | 23.9 ± 0.36 | 23.1 ± 0.77 | 24.4±0.70 | 24.6 ± 0.12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272.7 ± 9.4 | 279 ± 7.0 | 14.4 ± 0.45 | 13.9 ± 0.52 | 14.7±0.26 | 14.3 ± 0.56 | 23.6 ± 0.73 | 23.7 ± 0.65 | 24.4 ± 0.91 | 24.1 ± 1.79 | |
| T/Qの | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| 調整後P値 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | ある | 313.7 ± 12.0 | 325.7 ± 9.1 | 329 ± 14.2 | 340±15.6 | 15.9±0.64 | 16.2 ± 0.08 | 15.7±0.70 | 15.9±0.73 | 26.2 ± 0.62 | 27.2 ± 0.9 | 26.9 ±1.0 | 25.3 ±1.1 |
| B | 311±16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330.7 ± 17.6 | 342 ± 16.9 | 15.3 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 15.1 ± 0.33 | 15.3 ± 0.86 | 27.1 ± 0.37 | 25.6 ± 1.27 | 27.5 ± 0.76 | 26.2 ± 0.99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| 調整後P値 | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
表3:ラットの1日の体重、摂餌量、水分摂取量の変化。
動画1:ネズミの鎮静と対処このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:ラットの拘束手順このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:ラットの採血手順このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画4:穿刺部位での止血圧迫。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットでは、尾静脈採血が最も一般的な採血方法であるが、麻酔薬の影響を受ける可能性があり、尾静脈のサイズが小さいため、1回で採取できる血液量が限られ、採血期間が長くなります4,5。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-タンデム質量分析(MS/MS)システムとラット尾静脈のキャピラリーマイクロサンプリング(CMS)を組み合わせることで、ラットで使用される血液の量を減らすことができます11が、すべての施設にこの高価な装置が装備されているわけではありません。球後神経叢/副鼻腔からの採血は、ラットに不安や痛みを引き起こすことが多く、不適切な操作はラットの視力と健康を損なうことさえあります。したがって、この方法はラット9の採血には推奨されない。
鎖骨下静脈は、ラットの大胸筋と三角筋の間に位置し、内鎖骨の3分の1で頸静脈に流れ込みます(図4)。Yangらの研究では、麻酔下のラットにおける鎖骨下静脈からの採血の成功率は、熟練したオペレーターによって約90%であり、その穿刺の開始から終了までの最小時間は65秒7であった。Wangらの研究では、垂直アプローチを用いてラット鎖骨下静脈から血液サンプルを採取しました。彼らの方法は麻酔を伴わなかったが、ラットを確実に制限するために2人の協力を必要とした6。この研究プロトコルは、採血の優れた利点を示しています。このプロトコルは、特別な拘束装置や麻酔施設を必要としません。適切な取り扱いにより、ラットは一般的に最小限の抵抗を示します。ラットの拘束から採血完了までの時間の中央値はわずか2分で、95%という驚異的な総合成功率を達成しました。この方法により、人的資源を大幅に節約し、採血に要する時間を短縮できます。さらに、得られた血漿サンプルは透明で透明であり、溶血や凝固イベントの発生が最小限に抑えられるため、実験の繰り返しが最小限に抑えられます。この技術の習熟度は、反復採血を必要とする大規模なラットの薬物動態および毒物学実験を管理するために特に価値があります。
私たちの研究では、採血の失敗の主な発生は4日目であり、これは繰り返しの穿刺によって引き起こされる静脈損傷に関連している可能性があります。穿刺を繰り返すと、血管壁が損傷して炎症反応を引き起こし、血管壁が厚くなって硬化し、血管の狭窄を誘発することさえあります。穿刺後に止血が不十分な場合、血管外に漏出した血液はさらに組織の浮腫や炎症を引き起こし、その後瘢痕組織の形成につながる可能性があります。これらの瘢痕組織は貫通しにくく、血管を引っ張って位置をずらす可能性があり、これらすべてが血管の位置を特定して穿刺することをより困難にします。私たちの研究では、26Gの注射器(0.45mm)を採血に使用しましたが、これは人間の静脈に比べて問題ありませんが、それでもラットの静脈にかなりの損傷を与えます。これは、最初の採血中に針が血管を通過するときの明確な浸透感によって証明されていますが、採血回数が増えるにつれて減少し、採血時間が長くなり、失敗率が高くなります。そのため、採血には細いインスリン針の使用を推奨し、採血後には血腫の発生を防ぐために適切な圧力をかけ、十分な静脈修復を可能にするために交互採血を行う必要があります。私たちの経験では、よく訓練された瀉血医は、26Gの針を使用して、同じラットの両側鎖骨下静脈から交互に24時間以内の8〜10回採血し、各採血の間に平均2〜3時間の間隔を空けることができます。ただし、ラットが耐えられる最大採血回数、回復期間、および採血サイクルは、使用するニードルゲージ、さまざまな実験で必要な採血間隔、および瀉血医の習熟度によって影響を受ける可能性があります。これらの要因は、今後の研究でさらに調査する必要があります。薬物動態実験に必要な集中採血では、左右の鎖骨下静脈から交互に採血することをお勧めします。本当に利用できない場合は、他の採血方法を補完することができます。
体重、水分消費量、および食物摂取量は、ラットの健康状態を評価するための最も基本的で簡単な指標です16。初期の研究では、1日あたり0.9 mL未満の頸静脈からの採血はラットの血行動態に影響を与えず、有意な体重減少をもたらさなかったことが示されていました。.しかし、採血が1.5mLを超えると、体重減少につながる可能性があります17。Yokoyaらの研究では、頸静脈からの反復マイクロサンプリング(毎回50μL、24時間以内に6〜7倍)は、ラットの体重や食物摂取量に影響を与えませんでした10。さらに、採血の方法はラットの体重と食物摂取量に影響を与える可能性があります。舌下静脈採血を使用した以前の研究では、初日に0.5〜1.0 mLの血液を24時間採取すると、ラットの体重が減少し、食物摂取量が減少しましたが、体重減少は有意ではありませんでした18。本研究では、採血期間中もラットの体重は着実に増加し、採餌・水分摂取量、採血関連合併症、死亡例等に有意な変化は見られず、安全性と信頼性が高いことが示されました。
採血を行う前にラットを拘束プロセスに順応させることで、ラットのストレスが軽減され、採血の成功率が向上する可能性が高いことを強調することが重要です。固定が不十分で静脈への曝露が不十分な場合、採血に失敗し、ラットが痛みに苦しむために局所的な静脈破裂を引き起こすことさえあります。軽度の症例では、これは顕著な皮下血腫をもたらす可能性があり、重症の場合、ラットの死亡につながる可能性があります。さらに、固定が不十分な場合、ネズミが逃げ出し、個体に害を及ぼす可能性があります。そのため、採血手順を進める前に、取り扱い技術を完全に習得することを強くお勧めします。また、肩関節を外側に回転させる力は、ラットの鎖骨骨折につながる可能性があるため、注意が必要です。
この研究の限界は、コルチコステロンレベルの変化を測定することやケージサイドモニタリングによって、ラットにおけるこの採血方法によって引き起こされるストレスの変化を体系的に評価しなかったことです。この記事のもう一つの制限は、対照として代替の採血方法がないことです。他の採血方法との長所と短所の比較については、今後の研究で取り上げる予定です。全体として、この研究では、麻酔を必要とせずにラットから単独で採血する方法を紹介します。このアプローチは、ラットから血液サンプルを採取するための簡単で迅速で安全な手段を提供します。
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Disclosures
著者は、開示すべき関連する金銭的または非金銭的利害関係を有していません。
Acknowledgments
本研究は、蘭州大学第二病院の翠英計画プロジェクト(Grant No.PR0121015)および甘粛省泌尿器系疾患研究重点実験室(助成金番号0412D2)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
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今月のJoVE、第201号、ラット、鎖骨下静脈、採血Erratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
