Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

أخذ عينات دم الوريد تحت الترقوة في الفئران الواعية

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/66075
Automatic Translation
*1,2,3, *4, 5, 6, 1,2,3
1Institute of Urology, Lanzhou University Second Hospital, 2Key Laboratory of Gansu Province for Urological Diseases, 3Gansu Nephro-Urological Clinical Center, 4The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 5The Second Clinical Medical College of Lanzhou University, 6Medical Experimental Center of Lanzhou University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

نقدم هنا مزيجا من القيود الفعالة للفئران وطرق ثقب الوريد تحت الترقوة التي تمكن من جمع الدم بسرعة وأمان وتكرار في الفئران دون تخدير.

Abstract

هناك العديد من الطرق المعمول بها للحصول على عينات دم متكررة من الفئران ، مع أكثر الطرق المستخدمة شيوعا هي أخذ عينات الوريد الجانبي بدون تخدير وأخذ عينات الوريد الوداجي مع التخدير. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق تتطلب المساعدة ومعدات التخدير وأحيانا تشكل صعوبات من حيث جمع الدم أو رداءة نوعية عينات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، تستهلك طرق جمع الدم هذه وقتا كبيرا وموارد بشرية عندما يكون أخذ عينات الدم المتكررة مطلوبا لعدد كبير من الفئران. تقدم هذه الدراسة تقنية لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران غير المخدرة من قبل فرد واحد بارع. يمكن الحصول على عينات دم مرضية للغاية عن طريق ثقب الوريد تحت الترقوة. أظهرت الطريقة معدل نجاح إجمالي مثير للإعجاب بنسبة 95٪ ، مع متوسط وقت يبلغ 2 دقيقة فقط من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم. علاوة على ذلك ، فإن إجراء عمليات جمع دم متتالية ضمن النطاق المحدد لا يلحق أي ضرر بالفئران. هذه الطريقة تستحق الترويج لجمع الدم ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية واسعة النطاق.

Introduction

الفئران هي واحدة من أكثر التجارب شيوعا ، وهناك العديد من الطرق للحصول على عينات الدم. بالنسبة للتجارب التي تتضمن جمع دم واحد في المرحلة الختامية ، يمكن الحصول على كمية كافية من الدم من خلال ثقب القلب أو جمع الدم من الشريان الأورطي البطني1. ومع ذلك ، تتطلب بعض الدراسات جمع الدم المتكرر من الفئران للدم الروتيني أو التحليل الكيميائي الحيوي ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية والسموم ، حيث يلزم جمع الدم المتكرر لتحديد امتصاص الأدوية وتوزيعها واستقلابها2.

حاليا ، على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم من الفئران ، على الرغم من عدم الحاجة إلى التخدير ، إلا أن هذه الطريقة يمكن أن تكون صعبة بالنسبة للمجموعات المتكررة ، وحجم الدم الذي تم جمعه صغير نسبيا 3,4. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يمكن جمع الدم من الأوردة الصافن والقضيب ، إلا أن كمية الدم التي تم الحصول عليها محدودة ، والتخدير مطلوب 1,5. علاوة على ذلك ، توفر عينات الدم التي تم جمعها من الضفيرة الوريدية تحت الفك السفلي ، وكذلك الأوردة تحت اللسان والوداجية وتحت الترقوة عينات عالية الجودة ولكنها تتطلب عادة تخديرا أو مساعدة عدة أفراد1،6،7،8،9. أخيرا ، لا يتطلب جمع الدم من الجيوب الأنفية / القناة خلف الحجاج تخديرا فحسب ، بل قد يتسبب أيضا في إصابة وإجهاد الفئران9.

عادة ما تكون جودة عينات الدم التي يتم الحصول عليها من الأوردة الرئيسية من أعلى المعايير1. في الوقت الحاضر ، وجدت بعض الدراسات أن أخذ العينات المجهرية المستمرة من خلال الوريد الوداجي هو طريقة مناسبة جدا للبحث السمي في الفئران على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب عادة قسطرة الوريد الوداجي10،11،12. لذلك ، يجدر استكشاف كيفية الحصول على عينات دم عالية الجودة وفقا لمبدأ 3R للبحوث الحيوانية دون تدخل جراحي. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقديم طريقة لاستخراج الدم بكفاءة من الوريد تحت الترقوة في الفئران. تتيح هذه التقنية الجمع السريع للعينات المرضية من خلال إجراء شخص واحد دون الحاجة إلى التخدير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

التزمت هذه الدراسة بالمبادئ التوجيهية الموضحة في الطبعة الثامنة من دليل رعاية واستخدام المختبر13. حصل البحث على موافقة من لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة لانتشو الثاني وتم توثيقه وفقا لإرشادات REACH 2.014. تم إيواء اثني عشر فأرا من Wistar الأصحاء (ستة ذكور تزن 290-330 جم وست إناث تزن 250-280 جم) تتراوح أعمارهم بين 12-16 أسبوعا في مختبر GLP للحيوانات بجامعة Lanzhou لمدة 3 أيام قبل التجربة الفعلية. كانت أقفاص الفئران المستخدمة من النوع R5 ، بقياس 545 مم × 395 مم × 200 مم ، وكانت مجهزة بمواد فراش معقم. تم تزويد جميع الفئران بإمكانية الوصول غير المقيد إلى كل من الطعام والماء. حافظ المختبر على متوسط رطوبة يبلغ 25٪ ، ومتوسط درجة حرارة 24 درجة مئوية ، ودورة ضوئية تتناوب بين النهار والليل (7:00 صباحا / 7:00 مساء). في ختام الدراسة ، تم القتل الرحيم لجميع بشكل إنساني باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران. للحصول على معلومات شاملة بشأن المواد والأدوات المستخدمة في هذه الدراسة ، يرجى الرجوع إلى جدول المواد.

1. حساب حجم العينة واختيار

  1. اختر طريقة معادلة الموارد15 لتقدير حجم عينة باستخدام المعادلة (1).
    E = إجمالي عدد - إجمالي عدد المجموعات (1)
    حيث E هي درجة حرية تحليل التباين (ANOVA) وتتراوح من 10 إلى 20.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تقسيم 12 إلى مجموعتين A و B (ثلاثة ذكور وثلاث إناث لكل مجموعة).
  2. حدد النتيجة الأولية لهذه الدراسة على أنها معدل النجاح واستهلاك الوقت لأخذ عينات الدم المتكررة من قبل فرد واحد.
  3. حدد مقاييس النتائج الثانوية على أنها تغيرات في وزن جسم الفئران ، وتناول الطعام والماء ، بالإضافة إلى حدوث الأحداث الضائرة (مثل كسور الترقوة ، والأورام الدموية تحت الجلد ، واسترواح الصدر ، والوفيات).
  4. تعريف أخذ عينات الدم الناجحة على أنها تستوفي المعايير التالية: ط) أقل من ثلاث ثقوب لجمع دم واحد ؛ ب) إجمالي الوقت (من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم) لا يتجاوز 5 دقائق ؛ و iii) تحقيق حجم الدم المستهدف مع الحصول على بلازما واضحة. اعتبر أي انحراف عن هذه المعايير فشلا في أخذ العينات.

2. ضبط النفس وجمع الدم

ملاحظة: تم جمع عينات الدم من فئران المجموعة A و B من قبل باحثين ذوي خبرة ، وكلاهما سحب ما لا يقل عن 100 عينة دم. تم جمع عينات الدم من كلا المجموعتين من الفئران لما مجموعه 96 مرة على مدار 4 أيام. لا تتطلب طريقة جمع الدم هذه تخديرا أو أجهزة تقييد إضافية للفئران. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تقنيات معالجة بارعة.

  1. في الساعة 8:00 صباحا في اليوم السابق لأخذ عينات الدم (اليوم 1) ، قم بتعيين كل فأر في قفصه الفردي أثناء وزن طعامه وماءه. بعد ذلك ، اطلب من باحث آخر ، أعمى عن القياسات ، تسجيل وزن الفئران واستهلاكها للطعام واستهلاك المياه كل يوم في الساعة 8:00 صباحا من اليوم 1 فصاعدا.
  2. لاتباع هذا البروتوكول ، قم أولا بسحب الدم في الساعة 10:00 صباحا ثم في الساعة 10:00 مساء كل يوم ، وجمع 0.15 مل من الدم بالتناوب من الأوردة تحت الترقوة على كلا الجانبين.
    ملاحظة: تم تحديد كمية الدم التي سيتم جمعها من خلال الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن يتحمله الجرذ الأقل وزنا في غضون أسبوع.
  3. اغسل حقنة تحتوي على هيبارين الصوديوم (25 وحدة / مل) وعقم موقع الحقن بالكحول.
  4. قم بضرب جلد ظهر الجرذ برفق وقرص رقبته بشكل متكرر لمساعدة الفئران على الاسترخاء (فيديو 1).
  5. باستخدام إبهام اليد غير المهيمنة والسبابة ، أمسك جلد رقبة الجرذ وارفعه بقوة (الشكل 1 أ والفيديو 1).
  6. بالتنسيق مع اليد المهيمنة ، استخدم الأصابع الثلاثة المتبقية وراحة اليد غير المهيمنة لتأمين الجلد الخلفي للفأر وشل حركة أطرافه الأمامية (الشكل 1B و C والفيديو 2).
    ملاحظة: إذا قاوم الجرذ أو كافح ، يمكن تكرار هذا الإجراء عدة مرات لمساعدة الفئران على التعود على المناولة. الخطوات التالية هي مفتاح جمع الدم بنجاح.
  7. باستخدام السبابة غير المهيمنة ، اضغط برفق على جلد رأس الجرذ بينما تساعد الأصابع الأخرى ، جنبا إلى جنب مع راحة اليد ، في تدوير مفصل الكتف للخارج. خلال هذه العملية ، استخدم اليد المهيمنة لتمديد مفصل كتف الجرذ بالكامل (الشكل 1D-F والفيديو 2).
  8. أمسك الجرذ بقوة باليد غير المهيمنة لمحاذاة رأس الجرذ وجسمه في خط مستقيم (الشكل 1G ، H). بعد ذلك ، استخدم اليد المهيمنة لتحديد موضع الترقوة وتأكيد موقع البزل (الشكل 1I والفيديو 2 والفيديو 3).
    ملاحظة: حلق الفئران ليست ضرورية. في الشكل 1 ، تم إجراء الحلاقة فقط لإظهار موضع الترقوة والثقب إلى حد كبير. عند تقييد الفئران ، وخاصة الفئران >350 جم ، فإن السماح للفأر بإراحة قدميه على سطح صلب سيساعد في دعم وزن الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المقيد مراقبة معدل التنفس لكل فأر أثناء جمع الدم للتأكد من أن ضبط النفس ليس ضيقا جدا ، مما قد يسبب ضائقة تنفسية.
  9. إمساك المحقنة بالتوازي مع جسم الجرذ في اليد المهيمنة ، مع توجيه طرف الإبرة لأعلى ومقياس المحقنة نحو المجرب ، والحفاظ على زاوية 15 درجة تقريبا مع خط الوسط لجسم الجرذ. أدخل الإبرة 0.5 سم أسفل الشق الترقوي (عند تقاطع الثلث القريب من الترقوة والقص) ، مع التأكد من بقاء الإبرة موازية لجسم الجرذ (الشكل 1J والفيديو 3).
    ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص لزاوية وعمق إدخال الإبرة لتجنب ثقب الأوعية الدموية أو التسبب في تلف غير مقصود للأوعية المجاورة.
  10. اسحب المحقنة برفق قليلا لخلق ضغط سلبي ، وغالبا ما يكون مصحوبا بإحساس واضح بالاختراق عند دخول الأوعية الدموية (واضح بشكل خاص أثناء جمع الدم الأولي). حافظ على هذا الوضع واجمع 0.1-1.0 مل من الدم بسرعة ثابتة حسب الحاجة (باتباع إرشادات IACUC لحوالي 4-5.3 مل / كجم من الدم أسبوعيا1) (الشكل 1K والفيديو 3).
  11. إذا لم يكن هناك دم عند الثقب ، فحاول ضبط زاوية الإبرة وعمقها برفق أو قم بتدوير المحقنة برفق (فيديو 3). إذا لم تنجح ثلاث محاولات متتالية على نفس الجانب ، أوقف كل النزيف ثم انتقل إلى الجانب الآخر للثقب.
    ملاحظة: ينصح بالثقب السريع عبر الجلد لمنع الفئران من النضال بسبب عدم الراحة.
  12. ضع قطعة قطن للإرقاء وأعد الفئران إلى قفصها (فيديو 4).
  13. معالجة عينات الدم وفقا للمتطلبات التجريبية.

3. معالجة عينات الدم

  1. تخلص من إبرة المحقنة في وعاء الأدوات الحادة. نقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل تم شطفه مسبقا بالهيبارين. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي ، واضبطه على 4 درجات مئوية و 1200 × جم ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق لفصل البلازما. انقل المصل باستخدام ماصة باستور سعة 1.0 مل إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: لمنع انحلال الدم بسبب الضغط ، قم بإزالة طرف الإبرة عند الضرورة. أثناء شفط البلازما ، تجنب سحب خلايا الدم من أسفل الأنبوب. في بعض الأحيان ، قد يجمع سطح المحقنة فراء الفئران. احرص على عدم السماح لأي فرو بدخول الأنبوب ، لأنه قد يؤدي إلى التخثر.

4. التحليل الإحصائي

  1. عرض جميع البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري واختبارها للتأكد من تجانس التباين.
  2. استخدم اختبار فيشر الدقيق لمقارنة معدلات النجاح بين المجموعات.
  3. استخدم اختبار t المستقل المكون من عينتين لمقارنة المتوسط العام بين المجموعتين.
  4. استخدم تحليل التباين (ANOVA) للقياسات المستمرة مثل وقت أخذ عينات الدم ووزن الجسم وتناول الطعام واستهلاك المياه. ضع في اعتبارك P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر عينات البلازما عالية الجودة لونا أصفر باهتا ووضوحا وشفافية ، خالية من أي مسحة حمراء أو تخثر ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. يوضح الشكل 2B انحلال الدم (الجانب الأيسر) أو التخثر (الجانب الأيمن) نتيجة لإجراءات غير لائقة ، على التوالي. على مدار 96 جلسة جمع دم في غضون 4 أيام ، كان متوسط أوقات جمع الدم الفردي للمجموعتين A و B 119.87 ± 33.62 ثانية و 123.28 ± 30.96 ثانية على التوالي. لم يكن هناك فرق كبير في أوقات جمع الدم بين المجموعتين على أساس يومي (t = 0.66 ، P = 0.54 ، الجدول 1). كانت أقصر أوقات جمع الدم الفردية 78 ثانية و 89 ثانية على التوالي.

كان متوسط عدد المحاولات المطلوبة لجمع دم واحد بنجاح 1.21 و 1.17 للمجموعتين A و B ، على التوالي. لم يكن هناك فرق كبير في عدد المحاولات بين المجموعتين (t = 0.58 ، P = 0.60 ، الجدول 2). وكانت معدلات النجاح الإجمالية 93.8٪ (45/48) و 95.8٪ (46/48) للمجموعتين A و B ، على التوالي ، مع عدم وجود فرق كبير في معدلات النجاح الإجمالية بين المجموعتين (P > 0.05 ، الجدول 1). لم يكن هناك فرق كبير في وقت جمع الدم في المجموعة ب في كل نقطة زمنية. في المجموعة أ ، كان وقت جمع الدم في اليوم الثاني أقل من ذلك في اليوم الرابع (105.75 ± 14.22 ثانية مقابل 144.5 ± 25.45 ثانية ، ر = 12.39 ، P < 0.01 ؛ الجدول 1) . بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تشير المزيد من المحاولات وأوقات الثقب الأطول إلى معدلات فشل أعلى (الشكل 3A-C). في اليوم الثالث ، واجهت المجموعة ب فشلا واحدا يعزى إلى انحلال الدم. في اليوم الرابع ، واجهت المجموعة أ ثلاثة إخفاقات: واحدة بسبب انحلال الدم والآخران بسبب عدم القدرة على الحصول على عينات الدم. كما شهدت المجموعة ب فشلا واحدا بسبب عدم القدرة على الحصول على عينة دم.

على مدار 4 أيام متتالية من الملاحظة ، أظهرت كلتا المجموعتين من الفئران زيادة ثابتة في الوزن. ظل تناول الماء والغذاء ثابتا نسبيا بين الفئران من نفس الجنس. طوال عملية جمع الدم بأكملها ، لم تكن هناك حالات لوفيات الفئران ، ولم تلاحظ أي مضاعفات كبيرة ، مثل كسور الترقوة أو استرواح الصدر أو الأورام الدموية في موقع البزل (الشكل 3D-F والجدول 3).

Figure 1
الشكل 1: طرق التثبيت وجمع الدم للوريد تحت الترقوة في الفئران. (A-H) التلاعب بالتثبيت ؛ (ط) موقع الترقوة وموقع جمع الدم؛ (J-L) عملية جمع الدم والإرقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: جمع عينات الدم بنجاح وفشل. (أ) عينات الدم النموذجية والبلازما المعزولة؛ (ب) عينات الدم المتحللة (اليسرى) والمتخثرة (اليمنى) الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تقييم فعالية وسلامة جمع الدم. (أ) متوسط وقت جمع الدم يوميا؛ (ب) متوسط عدد الثقوب في اليوم ؛ (ج) معدلات نجاح وفشل جمع الدم في كلتا المجموعتين؛ (D-F) التغيرات في وزن الجسم ، وتناول الطعام ، وتناول الماء أثناء جمع الدم في كلتا المجموعتين من الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تشريح أوعية عنق الفئران. (أ) الهياكل التشريحية السطحية؛ ب: التراكيب التشريحية العميقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مجموعة الوقت متوسط وقت (مرات) جمع الدم
اليوم 1 اليوم 2* اليوم 3 اليوم 4
A 10:00 صباحا 92.83 ± 7.38 100.5 ± 17.36 117.83 ± 12.02 146.6 ± 24.76
10:00 مساء 108.67 ± 10.86 111.00 ± 6.95 158.33 ± 60.47 142.40 ± 25.96
متوسط الوقت 100.75 ± 12.20 105.75 ± 14.22 138.08 ± 48.07 144.5 ± 25.45
نسبة النجاح 100% (12/12) 100% (12/12) 100% (12/12) 75% (9/12)
معدل النجاح العام 93.8% (45/48)
متوسط الوقت الإجمالي 119.87 ± 33.62
B 10:00 صباحا 98.17 ± 7.24 110.17 ± 14.33 123.67 ± 30.99 147.2 ± 17.47
10:00 مساء 106.00 ± 14.35 126.67 ± 17.12 123.17 ± 17.50 165.67 ± 49.70
متوسط الوقت 102.08 ± 12.02 118.42 ± 17.82 123.92 ± 25.16 157.27 ± 39.63
نسبة النجاح 100% (12/12) 100% (12/12) 91.7% (11/12) 91.7% (11/12)
معدل النجاح العام 95.8% (46/48)
متوسط الوقت الإجمالي 123.28 ± 30.96

الجدول 1: أوقات جمع الدم ومعدلات نجاح مجموعتي الفئران. * كان وقت جمع الدم في اليوم الثاني أقل من وقت اليوم الرابع في المجموعة A (t = 12.39 P < 0.01).

مجموعة الوقت متوسط عدد الثقوب
اليوم 1 اليوم 2 اليوم 3 اليوم 4
A 10:00 صباحا 1 1 1 1.67
10:00 مساء 1 1 1.33 1.67
متوسط 1 1 1.17 1.67
المعدل العام 1.21
B 10:00 صباحا 1 1 1.17 1.5
10:00 مساء 1.17 1 1.17 1.33
متوسط 1.08 1 1.17 1.42
المعدل العام 1.17

الجدول 2: متوسط عدد الثقوب لجمع الدم في الفئران.

جنس مجموعة الوزن (جم) تناول الطعام (غ) كمية المياه (غ)
اليوم 1 اليوم 2 اليوم 3 اليوم 4 اليوم 1 اليوم 2 اليوم 3 اليوم 4 اليوم 1 اليوم 2 اليوم 3 اليوم 4
♀ A 260 ± 7.5 267.7 ± 6.3 271 ± 5.4 278 ± 6.5 13.3 ± 0.79 13.5 ± 0.93 14.0 ± 0.29 14.0 ± 0.77 23.9 ± 0.36 23.1 ± 0.77 24.4 ± 0.70 24.6 ± 0.12
B 262 ± 12.8 268.3 ± 14.0 272.7 ± 9.4 279 ± 7.0 14.4 ± 0.45 13.9 ± 0.52 14.7 ± 0.26 14.3 ± 0.56 23.6 ± 0.73 23.7 ± 0.65 24.4 ± 0.91 24.1 ± 1.79
تي / ف 0.35 0.09 0.38 0.23 2.44 1.22 2.34 1.12 0.43 0.76 0.00 0.71
قيمة P المعدلة >0.99 >0.99 >0.99 >0.99 0.68 0.98 0.71 0.99 >0.99 >0.99 >0.99 >0.99
♂ A 313.7 ± 12.0 325.7 ± 9.1 329 ± 14.2 340 ± 15.6 15.9 ± 0.64 16.2 ± 0.08 15.7 ± 0.70 15.9 ± 0.73 26.2 ± 0.62 27.2 ± 0.9 26.9 ± 1.0 25.3 ± 1.1
B 311 ± 16.4 322.3 ± 18.0 330.7 ± 17.6 342 ± 16.9 15.3 ± 0.74 15.7 ± 0.85 15.1 ± 0.33 15.3 ± 0.86 27.1 ± 0.37 25.6 ± 1.27 27.5 ± 0.76 26.2 ± 0.99
q 1.50 1.88 0.94 1.13 2.34 1.85 2.10 1.97 1.90 3.57 1.24 1.82
قيمة P المعدلة 0.94 0.86 >0.99 0.99 0.71 0.87 0.79 0.83 0.86 0.33 0.98 0.88

الجدول 3: التغيرات في وزن الجسم اليومي ، وتناول الطعام ، وتناول الماء من الفئران.

فيديو 1: تهدئة الفئران والتعامل معها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: إجراءات تقييد الفئران. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 3: إجراء جمع الدم للفئران. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 4: ضغط مرقئ في موقع البزل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران ، إلا أنه قد يتأثر بأدوية التخدير ، وبسبب صغر حجم الوريد الذيل ، فإن كمية الدم التي يمكن جمعها في حالة واحدة محدودة ، مما يؤدي إلى مدة أطول لجمع الدم 4,5. على الرغم من أن أنظمة قياس الطيف الكتلي الترادفية (MS / MS) عالية الأداء للكروماتوغرافيا السائلة (HPLC) جنبا إلى جنب مع أخذ العينات المجهرية الشعرية (CMS) لأوردة ذيل الفئران يمكن أن تقلل من كمية الدم المستخدمة في الفئران11 ، ليست كل المؤسسات مجهزة بهذه المعدات باهظة الثمن. غالبا ما يسبب أخذ عينات الدم من الضفيرة / الجيوب الأنفية خلف البصلي القلق والألم لدى الفئران ، ويمكن أن يؤدي التشغيل غير السليم إلى إتلاف رؤية وصحة الفئران. لذلك ، لا ينصح بهذه الطريقة لأخذ عينات الدم في الفئران9.

يقع الوريد تحت الترقوة بين العضلة الصدرية الكبرى والدالية للفأر ويصب في الوريد الوداجي في ثلث الترقوة الداخلية (الشكل 4). في الدراسة التي أجراها Yang et al. ، كان معدل نجاح جمع الدم من الوريد تحت الترقوة في الفئران تحت التخدير حوالي 90 ٪ من قبل عامل ماهر ، كان الحد الأدنى من الوقت من البداية إلى نهاية البزل 65 s7. في دراسة وانغ وآخرون ، تم جمع عينات الدم من الوريد تحت الترقوة للفئران باستخدام نهج عمودي. على الرغم من أن طريقتهم لم تتضمن التخدير ، إلا أنها تطلبت تعاون شخصين لتقييد الجرذ6 بشكل آمن. يظهر بروتوكول الدراسة هذا ميزة جيدة لجمع الدم. لا يتطلب هذا البروتوكول أي أجهزة تقييد خاصة أو مرفق تخدير. مع التعامل السليم ، تظهر الفئران عموما الحد الأدنى من المقاومة. كان متوسط الوقت من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم 2 دقيقة فقط ، مما حقق معدل نجاح إجمالي مثير للإعجاب بنسبة 95٪. هذه الطريقة تحافظ بشكل كبير على الموارد البشرية وتقلل من الوقت اللازم لجمع الدم. علاوة على ذلك ، فإن عينات البلازما التي تم الحصول عليها واضحة وشفافة ، مع الحد الأدنى من حدوث انحلال الدم وأحداث التخثر ، وبالتالي تقليل تكرار التجربة. تعتبر الكفاءة في هذه التقنية ذات قيمة خاصة لإدارة الحرائك الدوائية للفئران على نطاق واسع وتجارب السموم التي تتطلب جمع الدم المتكرر.

في دراستنا ، كان الحدوث الرئيسي لفشل سحب الدم في اليوم 4 ، والذي قد يكون مرتبطا بالضرر الوريدي الناجم عن الثقوب المتكررة. يمكن أن تؤدي الثقوب المتكررة إلى تلف جدار الأوعية الدموية وإثارة استجابة التهابية ، مما يتسبب في زيادة سماكة جدار الأوعية الدموية وتصلبها ، وحتى إحداث تضييق الأوعية الدموية. إذا كان الإرقاء غير كاف بعد ثقب ، يمكن أن يسبب الدم المنتشر وذمة الأنسجة والالتهابات ، مما يؤدي لاحقا إلى تكوين أنسجة ندبة. يصعب اختراق هذه الأنسجة الندبية ويمكن أن تسحب أيضا وتتسبب في تغيير الأوعية الدموية لموقعها ، وكل ذلك يجعل تحديد موقع الأوعية الدموية وثقبها أكثر صعوبة. في دراستنا ، تم استخدام حقنة 26G (0.45mm) لجمع الدم ، وهو أمر جيد بالنسبة للأوردة البشرية ولكنه لا يزال يسبب أضرارا كبيرة لأوردة الفئران. يتضح هذا من خلال الإحساس الواضح بالاختراق عندما تمر الإبرة عبر الوعاء أثناء سحب الدم الأول ، والذي يتضاءل مع زيادة عدد عمليات سحب الدم ، مع أوقات أطول لجمع الدم ومعدلات فشل أعلى. لذلك ، نوصي باستخدام إبرة أنسولين أدق لجمع الدم ، ويجب الضغط الكافي بعد جمع الدم لمنع تكوين ورم دموي ، ويجب إجراء عمليات سحب دم بديلة للسماح بإصلاح وريدي كاف. في تجربتنا ، يمكن لأخصائي الفصد المدرب جيدا استخدام إبرة 26G لسحب الدم بالتناوب من الأوردة تحت الترقوة الثنائية لنفس الجرذ 8-10 مرات في غضون 24 ساعة ، بمتوسط فاصل زمني من 2-3 ساعات بين كل سحب دم. ومع ذلك ، فإن الحد الأقصى لعدد عمليات سحب الدم التي يمكن أن يتحملها الجرذ ، وفترة الشفاء ، ودورة سحب الدم قد تتأثر بمقياس الإبرة المستخدم ، وفترات سحب الدم التي تتطلبها التجارب المختلفة ، وكفاءة الفصد. هذه العوامل تحتاج إلى مزيد من الاستكشاف في البحوث المستقبلية. لأخذ عينات الدم المكثفة المطلوبة لتجارب الحرائك الدوائية ، من الأفضل جمع الدم بالتناوب من الأوردة تحت الترقوة اليسرى واليمنى. في الحالات التي يكون فيها غير متوفر حقا ، يمكن استكمال طرق أخرى لجمع الدم.

وزن الجسم واستهلاك المياه وتناول الطعام هي المؤشرات الأساسية والمباشرة لتقييم الحالة الصحية للفئران16. أظهرت دراسة مبكرة أن جمع الدم عبر الوريد الوداجي الذي يقل عن 0.9 مل يوميا لم يؤثر على ديناميكا الدم لدى الفئران ولم يؤد إلى أي خسارة كبيرة في الوزن. ومع ذلك ، عندما يتجاوز جمع الدم 1.5 مل ، يمكن أن يؤدي إلى فقدان الوزن17. في الدراسة التي أجراها Yokoya et al. ، لم يؤثر أخذ العينات المجهرية المتكررة من الوريد الوداجي (50 ميكرولتر في كل مرة ، 6-7x خلال 24 ساعة) على وزن جسم الفئران أو تناول الطعام10. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر طريقة جمع الدم على وزن الجسم وتناول الطعام للفئران. في دراسة سابقة باستخدام جمع الدم الوريدي تحت اللسان ، أدى جمع 24 ساعة من 0.5-1.0 مل من الدم في اليوم الأول إلى انخفاض في وزن جسم الفئران وانخفاض تناول الطعام ، على الرغم من أن فقدان الوزن لم يكن كبيرا18. في هذه الدراسة ، لا يزال وزن جسم الفئران يزداد بشكل مطرد خلال فترة جمع الدم ، ولم تكن هناك تغييرات كبيرة في تناول الطعام والماء ، والمضاعفات المرتبطة بجمع الدم ، وموت الفئران ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة آمنة وموثوقة.

من الأهمية بمكان التأكيد على أن تأقلم الفئران مع عملية ضبط النفس قبل إجراء جمع الدم من المرجح أن يقلل من الضغط في الفئران ويحسن معدل نجاح جمع الدم. يمكن أن يؤدي التثبيت غير الكافي وعدم كفاية التعرض للوريد إلى فشل جمع الدم وحتى التسبب في تمزق الوريد المحلي بسبب معاناة الفئران من الألم. في الحالات الأكثر اعتدالا ، قد يؤدي ذلك إلى أورام دموية ملحوظة تحت الجلد ، بينما في الحالات الشديدة ، قد يؤدي إلى وفيات الفئران. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التثبيت السيئ إلى هروب الفئران والتسبب في ضرر للأفراد. لذلك ، نوصي بشدة بإتقان تقنية المناولة بدقة قبل الشروع في إجراء جمع الدم. علاوة على ذلك ، من المهم توخي الحذر مع القوة المطبقة لتدوير مفصل الكتف خارجيا ، لأن الضغط المفرط قد يؤدي إلى كسور الترقوة في الفئران.

أحد قيود هذه الدراسة هو أننا لم نقيم بشكل منهجي التغيرات في الإجهاد الناجم عن طريقة جمع الدم هذه في الفئران عن طريق قياس التغيرات في مستوى الكورتيكوستيرون أو عن طريق المراقبة من جانب القفص ، والتي تحتاج إلى استكشافها في الأبحاث المستقبلية. قيد آخر لهذه المقالة هو عدم وجود طرق بديلة لجمع الدم كعنصر تحكم. سيتم تناول المقارنات مع طرق جمع الدم الأخرى لمزاياها وعيوبها في الأبحاث المستقبلية. إجمالا ، تقدم هذه الدراسة طريقة لجمع الدم لشخص واحد من الفئران دون الحاجة إلى التخدير. يوفر هذا النهج وسيلة مباشرة وسريعة وآمنة للحصول على عينات الدم من الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للكشف عنها.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع خطة Cuiying للمستشفى الثاني بجامعة لانتشو (Grant No. PR0121015) والمختبر الرئيسي لمقاطعة قانسو لبحوث أمراض الجهاز البولي (المنحة رقم 0412D2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.75% normal saline Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. —— Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette  Biosharp BS-XG-01-NS Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. 0.45*12RWLB Blood collection 
1.5 mL Eppendorf tube Biosharp BS-15-M Blood storage and collection
75% medical alcohol Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. —— Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder Biosharp BS-05/15-SM60 ——
Electronic scale Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. JE1002 Weigh
Heparin sodium injection Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. —— Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.  H1750R Separation of serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
  2. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  3. Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
  4. Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
  5. Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
  6. Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
  7. Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
  8. Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
  9. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  10. Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
  11. Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
  12. Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
  13. National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  14. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
  17. Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
  18. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 201 ، الجرذ ، الوريد تحت الترقوة ، أخذ عينات الدم

Erratum

Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.

The third paragraph in the Discussion section was updated from:

In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.

to:

In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.

أخذ عينات دم الوريد تحت الترقوة في الفئران الواعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X. h., Peng, S., Pei, Z. x.,… More

Zhang, X. h., Peng, S., Pei, Z. x., Sun, J., Wang, Z. p. Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. J. Vis. Exp. (201), e66075, doi:10.3791/66075 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter