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Summary
Apresentamos aqui uma combinação de métodos eficazes de restrição em ratos e punção da veia subclávia que permitem a coleta de sangue rápida, segura e repetida em ratos sem anestesia.
Abstract
Existem vários métodos estabelecidos para a obtenção de repetidas amostras de sangue de ratos, sendo os métodos mais comumente empregados a amostragem da veia caudal lateral sem anestesia e a amostragem da veia jugular com anestesia. No entanto, a maioria desses métodos requer assistência e equipamentos anestésicos e, por vezes, apresentam dificuldades em termos de coleta de sangue ou da má qualidade das amostras de sangue. Além disso, esses métodos de coleta de sangue consomem tempo e recursos humanos significativos quando amostras repetidas de sangue são necessárias para um grande número de ratos. Este estudo apresenta uma técnica de coleta repetitiva de sangue em ratos não anestesiados por um único indivíduo proficiente . Amostras de sangue altamente satisfatórias podem ser obtidas puncionando a veia subclávia. O método demonstrou uma impressionante taxa de sucesso global de 95%, com um tempo mediano de apenas 2 min desde a contenção do rato até a conclusão da coleta de sangue. Além disso, a realização de coletas consecutivas de sangue dentro da faixa designada não causa nenhum dano aos ratos. Este método vale a pena promover para a coleta de sangue, especialmente em estudos farmacocinéticos em larga escala.
Introduction
Os ratos são um dos animais experimentais mais comuns, e existem muitas maneiras de obter amostras de sangue. Para experimentos que envolvam uma única coleta de sangue na fase final, uma quantidade suficiente de sangue pode ser obtida por punção cardíaca ou coleta de sangue da aorta abdominal1. No entanto, alguns estudos requerem repetidas coletas de sangue de ratos para análises de rotina de sangue ou bioquímicas, especialmente em estudos farmacocinéticos e toxicológicos, onde coletas repetidas de sangue são necessárias para determinar a absorção, distribuição e metabolismo de drogas2.
Atualmente, embora a coleta de sangue da veia caudal seja o método mais comum para coleta de sangue de ratos, apesar de não necessitar de anestesia, esse método pode ser desafiador para coletas repetidas, e o volume de sangue coletado é relativamente pequeno 3,4. Além disso, embora o sangue possa ser coletado das veias safena e peniana, a quantidade de sangue obtida é limitada, sendo necessária anestesia 1,5. Além disso, amostras de sangue coletadas do plexo venoso submandibular, bem como das veias sublingual, jugular e subclávia fornecem amostras de melhor qualidade, mas tipicamente requerem anestesia ou assistência de múltiplos indivíduos 1,6,7,8,9. Finalmente, a coleta de sangue do seio retro-orbital/canal não só necessita de anestesia, mas também pode potencialmente causar lesão e estresse aos ratos9.
A qualidade das amostras de sangue tipicamente obtidas das principais veias é geralmente do mais alto padrão1. Atualmente, alguns estudos constataram que a microamostragem contínua através da veia jugular é um método muito adequado para pesquisa toxicológica em ratos, embora esse método geralmente necessite de cateterização da veia jugular10,11,12. Portanto, vale a pena explorar como obter amostras de sangue de alta qualidade de acordo com o princípio 3R da pesquisa animal sem intervenção cirúrgica. O objetivo deste estudo foi apresentar um método eficiente de extração de sangue da veia subclávia em ratos. Esta técnica permite a rápida coleta de amostras satisfatórias através de um procedimento unipessoal, sem a necessidade de anestesia.
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Protocol
Este estudo seguiu as diretrizes descritas na 8ª edição do Guide for the Care and Use of Laboratory Animals13. A pesquisa recebeu aprovação do Comitê de Ética do Lanzhou University Second Hospital e foi documentada em conformidade com as diretrizes do ARRIVE 2.014. Doze ratos Wistar saudáveis (seis machos pesando 290-330 g e seis fêmeas pesando 250-280 g) com idades entre 12-16 semanas foram acomodados no Laboratório de Animais GLP da Universidade de Lanzhou por 3 dias antes do experimento real. As gaiolas utilizadas foram do tipo R5, medindo 545 mm x 395 mm x 200 mm, e equipadas com material de cama autoclavado. Todos os ratos tiveram acesso irrestrito a água e ração. O laboratório manteve umidade média de 25%, temperatura média de 24 °C e ciclo de luz alternado entre dia e noite (7h00/19h00). Na conclusão do estudo, todos os animais foram sacrificados humanamente usando uma overdose de isoflurano. Para obter informações abrangentes sobre os materiais e instrumentos empregados neste estudo, consulte a Tabela de Materiais.
1. Cálculo do tamanho da amostra e seleção dos animais
- Escolha o método da equação do recurso15 para estimar o tamanho da amostra animal usando a equação (1).
E = Número total de animais − Número total de grupos (1)
Onde E é o grau de liberdade de análise de variância (ANOVA) e varia de 10 a 20.
OBS: Neste estudo, 12 animais foram divididos em dois grupos A e B (três machos e três fêmeas por grupo). - Definir o desfecho primário deste estudo como a taxa de sucesso e o consumo de tempo de repetidas coletas de sangue por um único indivíduo.
- Definir as medidas de desfecho secundário como alterações no peso corporal do rato, ingestão de alimento e água, bem como a incidência de eventos adversos (como fraturas da clavícula, hematomas subcutâneos, pneumotórax e mortalidade).
- Definir coleta de sangue bem-sucedida como atendendo aos seguintes critérios: i) menos de três punções para uma única coleta de sangue; ii) um tempo total (desde a contenção do rato até a conclusão da coleta de sangue) não superior a 5 min; e iii) atingir o volume sanguíneo desejado durante a obtenção de plasma claro. Considere qualquer desvio desses critérios uma falha de amostragem.
2. Contenção de animais e coleta de sangue
NOTA: Amostras de sangue de ratos do grupo A e B foram coletadas por dois pesquisadores experientes, ambos com pelo menos 100 amostras de sangue. Amostras de sangue foram coletadas de ambos os grupos de ratos por um total de 96 vezes ao longo de 4 dias. Este método de coleta de sangue não requer anestesia ou dispositivos de retenção adicionais para os ratos. No entanto, necessita de técnicas de manuseio hábeis.
- Às 8:00 da manhã do dia anterior à coleta de sangue (dia 1), atribua cada rato à sua gaiola individual enquanto sua comida e água são pesadas. Em seguida, peça a outro pesquisador, cego para as medidas, que registre o peso, o consumo de alimentos e a ingestão de água dos ratos todos os dias às 8:00 da manhã a partir do dia 1.
- Para seguir esse protocolo, primeiramente a coleta de sangue às 10:00 horas e depois às 22:00 horas todos os dias, coletando-se 0,15 mL de sangue alternadamente das veias subclávias de ambos os lados.
NOTA: A quantidade de sangue a ser coletada foi determinada pelo volume máximo que o rato de menor peso poderia tolerar dentro de uma semana. - Lave uma seringa com heparina sódica (25 U/mL) e desinfete o local da injeção com álcool.
- Acaricie suavemente a pele das costas do rato e aperte seu pescoço repetidamente para ajudar o rato a relaxar (Vídeo 1).
- Com o polegar e o indicador da mão não dominante, segure e levante firmemente a pele do pescoço do rato (Figura 1A e Vídeo 1).
- Com coordenação da mão dominante, utilizar os três dedos restantes e a palma da mão não dominante para fixar a pele posterior do rato e imobilizar seus membros anteriores (Figura 1B,C e Vídeo 2).
NOTA: Se o rato resistir ou lutar, este procedimento pode ser repetido várias vezes para ajudar o rato a se acostumar com o manuseio. Os passos a seguir são fundamentais para o sucesso da coleta de sangue. - Usando o dedo indicador da mão não dominante, empurre suavemente para baixo a pele da cabeça do rato, enquanto os outros dedos, juntamente com a palma da mão, ajudam a girar externamente a articulação do ombro. Durante esse processo, utilizar a mão dominante para estender totalmente a articulação do ombro do rato (Figura 1D-F e Vídeo 2).
- Segure o rato firmemente com a mão não dominante para alinhar a cabeça e o corpo do rato em linha reta (Figura 1G,H). Em seguida, utilizar a mão dominante para localizar a posição da clavícula e confirmar o local da punção (Figura 1I, Vídeo 2 e Vídeo 3).
NOTA: Não é necessário raspar o rato. Na Figura 1, a tricotomia foi realizada apenas para maior extensão da clavícula e da punção. Ao conter ratos, especialmente ratos >350 g, permitir que o rato apoie seus pés em uma superfície sólida ajudará a suportar seu peso corporal. Além disso, o retentor deve monitorar a frequência respiratória de cada rato durante a coleta de sangue para garantir que a contenção não seja muito apertada, o que pode causar desconforto respiratório. - Segurando a seringa paralela ao corpo do rato na mão dominante, com a ponta da agulha voltada para cima e a escala da seringa em direção ao experimentador, mantenha um ângulo de aproximadamente 15° com a linha média do corpo do rato. Inserir a agulha 0,5 cm abaixo da incisura da clavícula (na junção do terço proximal da clavícula com o esterno), garantindo que a agulha permaneça paralela ao corpo do rato (Figura 1J e Vídeo 3).
NOTA: Atenção especial deve ser dada ao ângulo e profundidade da inserção da agulha para evitar perfurar o vaso sanguíneo ou causar danos inadvertidos aos vasos adjacentes. - Retire suavemente a seringa ligeiramente para criar uma pressão negativa, muitas vezes acompanhada por uma sensação palpável de ruptura ao entrar no vaso sanguíneo (particularmente pronunciada durante a colheita de sangue inicial). Manter essa posição e coletar 0,1-1,0 mL de sangue em velocidade constante, conforme necessário (seguindo as diretrizes da IACUC de aproximadamente 4-5,3 mL/kg de sangue por semana1) (Figura 1K e Vídeo 3).
- Se não houver sangue no momento da punção, tente ajustar suavemente o ângulo e a profundidade da agulha ou gire suavemente a seringa (Vídeo 3). Se três tentativas consecutivas do mesmo lado não forem bem-sucedidas, pare todo o sangramento e, em seguida, mude para o lado oposto para a punção.
NOTA: A punção rápida através da pele é aconselhável para evitar que o rato lute devido ao desconforto. - Aplicar um cotonete para hemostasia e retornar o rato à sua gaiola (Vídeo 4).
- Processar as amostras de sangue de acordo com as exigências experimentais.
3. Processamento de amostras de sangue
- Descarte a agulha da seringa em um recipiente para materiais perfurocortantes. Transferir o sangue coletado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente lavado com heparina. Coloque o tubo em uma centrífuga, fixando-o a 4 °C e 1.200 x g, e centrifugue por 10 min para separar o plasma. Transfira o soro utilizando uma pipeta de Pasteur de 1,0 ml para um tubo de microcentrífuga limpo e armazene-o a -80 °C.
NOTA: Para evitar hemólise devido à pressão, remova a ponta da agulha quando necessário. Durante a aspiração de plasma, evite retirar células sanguíneas do fundo do tubo. Ocasionalmente, a superfície da seringa pode coletar pelos de ratos; Tome cuidado para não permitir que nenhum pelo entre no tubo, pois pode levar à coagulação.
4. Análise estatística
- Apresentar todos os dados como média ± desvio padrão e testá-los quanto à homogeneidade da variância.
- Use o teste exato de Fisher para comparar as taxas de sucesso entre os grupos.
- Use um teste t independente para duas amostras para comparar as médias gerais entre os dois grupos.
- Use a análise de variância (ANOVA) para medidas contínuas, como tempo de coleta de sangue, peso corporal, ingestão alimentar e consumo de água. Considere P < 0,05 estatisticamente significante.
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Representative Results
Espécimes de plasma de alta qualidade exibem uma tonalidade amarelo-pálida, clareza e transparência, desprovidos de qualquer coloração vermelha ou coagulação, como mostrado na Figura 2A. A Figura 2B mostra hemólise (lado esquerdo) ou coagulação (lado direito) como resultado de procedimentos inadequados, respectivamente. Ao longo de 96 sessões de coleta de sangue em 4 dias, os tempos médios de coleta única para os grupos A e B foram de 119,87 ± 33,62 s e 123,28 ± 30,96 s, respectivamente. Não houve diferença significativa nos tempos de coleta de sangue entre os dois grupos diariamente (t = 0,66, P = 0,54, Tabela 1). Os menores tempos de coleta individual de sangue foram 78 s e 89 s, respectivamente.
O número médio de tentativas necessárias para uma única coleta de sangue bem-sucedida foi de 1,21 e 1,17 para os grupos A e B, respectivamente. Não houve diferença significativa no número de tentativas entre os dois grupos (t = 0,58, P = 0,60, Tabela 2). As taxas globais de sucesso foram de 93,8% (45/48) e 95,8% (46/48) para os grupos A e B, respectivamente, sem diferença significativa nas taxas de sucesso global entre os dois grupos (P > 0,05, Tabela 1). Não houve diferença significativa no tempo de coleta de sangue no grupo B em cada momento. No grupo A, o tempo de coleta de sangue no segundo dia foi menor que no quarto dia (105,75 ± 14,22s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabela 1) . Além disso, mais tentativas e maior tempo de punção frequentemente indicam maiores taxas de falha (Figura 3A-C). No terceiro dia, o Grupo B encontrou uma falha atribuída à hemólise. No quarto dia, o grupo A encontrou três falhas: uma por hemólise e as outras duas pela impossibilidade de obtenção de amostras de sangue. O grupo B também apresentou uma falha devido à incapacidade de obter uma amostra de sangue.
Ao longo de 4 dias consecutivos de observação, ambos os grupos de ratos apresentaram ganho de peso constante. A ingestão de água e ração permaneceu relativamente constante entre ratos do mesmo sexo. Durante todo o processo de coleta de sangue, não houve casos de mortalidade de ratos, nem complicações significativas, como fraturas da clavícula, pneumotórax ou hematomas no sítio de punção (Figura 3D-F e Tabela 3).
Figura 1: Métodos de fixação e coleta de sangue da veia subclávia em ratos. (A-H) Manipulação da fixação; (I) localização da clavícula e local de coleta de sangue; (J-L) o processo de coleta de sangue e hemostasia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Amostras de sangue coletadas com e sem sucesso. (A) Amostras típicas de sangue e plasma isolado; (B) amostras de sangue hemolisado (esquerdo) e coagulado (direito) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da efetividade e segurança da coleta de sangue. (A) Tempo médio de coleta de sangue por dia; (B) número médio de punções por dia; (C) as taxas de sucesso e falha na coleta de sangue em ambos os grupos; (D-F) alterações no peso corporal, ingestão alimentar e ingestão hídrica durante a coleta de sangue em ambos os grupos de ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Anatomia dos vasos do pescoço de ratos. (A) Estruturas anatômicas superficiais; (B) estruturas anatômicas profundas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupo | Hora | Tempo médio de coleta de sangue (s) | |||
| Dia 1 | Dia 2* | Dia 3 | Dia 4 | ||
| Um | 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108,67 ± 10,86 | 111,00 ± 6,95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Tempo médio | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Taxa de sucesso | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Taxa de sucesso geral | 93.8% (45/48) | ||||
| Tempo médio geral | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 | 98,17 ± 7,24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126,67 ± 17,12 | 123,17 ± 17,50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Tempo médio | 102,08 ± 12,02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Taxa de sucesso | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Taxa de sucesso geral | 95.8% (46/48) | ||||
| Tempo médio geral | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabela 1: Tempos de coleta de sangue e taxas de sucesso dos dois grupos de ratos. *O tempo de coleta de sangue do segundo dia foi menor que o do quarto dia no grupo A (t = 12,39 P < 0,01).
| Grupo | Hora | Número médio de punções | |||
| Dia 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | ||
| Um | 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Média | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Média geral | 1.21 | ||||
| B | 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Média | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Média geral | 1.17 | ||||
Tabela 2: Número médio de punções para coleta de sangue em ratos.
| Gênero | Grupo | Peso (g) | Consumo alimentar (g) | Ingestão de água (g) | |||||||||
| Dia 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | Dia 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | Dia 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | ||
| ♀ | Um | 260 ± 7.5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7.0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| t/q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Valor de p ajustado | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | Um | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16.4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16.9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Valor de p ajustado | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabela 3: Alterações no peso corporal diário, ingestão alimentar e ingestão hídrica de ratos.
Vídeo 1: Acalmar e manusear ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Procedimentos de contenção para ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: O procedimento de coleta de sangue para ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 4: Compressão hemostática no local da punção. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Embora a coleta de sangue da veia caudal seja o método mais comum para repetidas coletas de sangue em ratos, ela pode ser influenciada por drogas anestésicas e, devido ao pequeno tamanho da veia caudal, a quantidade de sangue que pode ser coletada em um único momento é limitada, levando a um maior tempo de coleta de sangue 4,5. Embora sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) - espectrometria de massas em tandem (MS/MS) combinados com microamostragem capilar (CMS) de veias da cauda de ratos possam reduzir a quantidade de sangue usada em ratos11, nem todas as instituições estão equipadas com esse equipamento caro. A coleta de sangue do plexo/seio retrobulbar muitas vezes causa ansiedade e dor em ratos, e a operação inadequada pode até prejudicar a visão e a saúde dos ratos. Portanto, esse método não é recomendado para coleta de sangue em ratos9.
A veia subclávia situa-se entre o músculo peitoral maior e o músculo deltoide do rato e drena para a veia jugular em um terço da clavícula interna (Figura 4). No estudo de Yang et al., a taxa de sucesso da coleta de sangue da veia subclávia em ratos sob anestesia foi de aproximadamente 90% por um operador experiente, cujo tempo mínimo do início ao fim da punção foi de 65 s7. No estudo de Wang et al., amostras de sangue foram coletadas da veia subclávia de ratos usando uma abordagem vertical. Embora seu método não envolvesse anestesia, ele exigiu a colaboração de dois indivíduos para restringir o rato com segurança6. Este protocolo de estudo mostra uma boa vantagem da coleta de sangue. Este protocolo não requer nenhum dispositivo especial de contenção ou instalação de anestesia. Com o manejo adequado, os ratos geralmente exibem resistência mínima. O tempo mediano desde a contenção do rato até a conclusão da coleta de sangue foi de apenas 2 min, alcançando uma impressionante taxa de sucesso global de 95%. Esse método conserva significativamente os recursos humanos e reduz o tempo necessário para a coleta de sangue. Além disso, as amostras de plasma obtidas são claras e transparentes, com ocorrência mínima de eventos de hemólise e coagulação, minimizando a repetição do experimento. A proficiência nessa técnica é particularmente valiosa para o gerenciamento de experimentos farmacocinéticos e toxicológicos em larga escala em ratos que exigem coleta repetitiva de sangue.
Em nosso estudo, a principal ocorrência de falha na coleta de sangue foi no 4º dia, o que pode estar relacionado ao dano venoso causado por punções repetidas. Punções repetidas podem levar a danos da parede vascular e provocar uma resposta inflamatória, fazendo com que a parede vascular engrosse e endureca, e até induza o estreitamento vascular. Se a hemostasia for inadequada após a punção, o sangue extravasado pode causar ainda edema tecidual e inflamação, levando posteriormente à formação de tecido cicatricial. Esses tecidos cicatriciais são difíceis de penetrar e também podem puxar e fazer com que os vasos sanguíneos mudem de posição, o que torna os vasos sanguíneos mais difíceis de localizar e perfurar. Em nosso estudo, uma seringa 26G (0,45mm) foi usada para a coleta de sangue, que é fina em relação às veias humanas, mas ainda causa danos consideráveis às veias de ratos. Isso é evidenciado pela nítida sensação de penetração quando a agulha passa pelo vaso durante a primeira coleta de sangue, que diminui à medida que aumenta o número de coletas de sangue, com maior tempo de coleta de sangue e maiores taxas de falha. Portanto, recomendamos o uso de uma agulha de insulina mais fina para a coleta de sangue, e pressão adequada deve ser aplicada após a coleta de sangue para evitar a formação de hematoma, e coletas de sangue alternadas devem ser realizadas para permitir reparo venoso suficiente. Em nossa experiência, um flebotomista bem treinado pode usar uma agulha 26G para coletar sangue alternadamente das veias subclávias bilaterais do mesmo rato 8-10 vezes dentro de 24 horas, com um intervalo médio de 2-3 horas entre cada coleta de sangue. No entanto, o número máximo de coletas de sangue que um rato pode tolerar, o período de recuperação e o ciclo de coleta de sangue podem ser influenciados pelo calibre da agulha usado, pelos intervalos de coleta de sangue exigidos por diferentes experimentos e pela proficiência do flebotomista. Esses fatores precisam ser mais explorados em pesquisas futuras. Para a amostragem de sangue intensiva necessária para experimentos de farmacocinética, é melhor coletar sangue alternadamente das veias subclávias esquerda e direita. Nos casos em que realmente não estiver disponível, outros métodos de coleta de sangue podem ser complementados.
O peso corporal, o consumo de água e a ingestão alimentar são os indicadores mais básicos e diretos para avaliar o estado de saúde de ratos16. Um estudo inicial havia mostrado que a coleta de sangue pela veia jugular de menos de 0,9 mL por dia não afetava a hemodinâmica de ratos e não resultava em perda de peso significativa. No entanto, quando a coleta de sangue excede 1,5 mL, pode levar à perda de peso17. No estudo de Yokoya e col., microamostras repetidas da veia jugular (50 μL cada vez, 6-7x dentro de 24 h) não afetaram o peso corporal ou a ingestão alimentarde ratos 10. Além disso, a forma de coleta de sangue pode afetar o peso corporal e a ingestão alimentar de ratos. Em um estudo anterior utilizando coleta de sangue da veia sublingual, uma coleta de 24 horas de 0,5-1,0 mL de sangue no primeiro dia resultou em redução do peso corporal de ratos e diminuição da ingestão alimentar, embora a perda de peso não tenha sido significativa18. Neste estudo, o peso corporal dos ratos ainda aumentou constantemente durante o período de coleta de sangue, e não houve mudanças significativas na ingestão de alimento e água, complicações relacionadas à coleta de sangue e morte dos ratos, indicando que este método é seguro e confiável.
É crucial enfatizar que aclimatar os ratos ao processo de contenção antes de realizar a coleta de sangue provavelmente diminuirá o estresse no rato e melhorará a taxa de sucesso da coleta de sangue. A fixação inadequada e a exposição insuficiente das veias podem levar a falhas na coleta de sangue e até mesmo causar ruptura venosa local devido à dor dos ratos. Em casos mais leves, isso pode resultar em hematomas subcutâneos perceptíveis, enquanto em casos graves, pode levar à morte de ratos. Além disso, a má fixação pode levar os ratos a escapar e causar danos aos indivíduos. Portanto, recomendamos fortemente dominar a técnica de manipulação antes de prosseguir com o procedimento de coleta de sangue. Além disso, é importante ter cautela com a força aplicada para rodar externamente a articulação do ombro, pois a pressão excessiva pode levar a fraturas da clavícula no rato.
Uma limitação deste estudo é que não avaliamos sistematicamente as mudanças no estresse induzido por esse método de coleta de sangue em ratos, medindo as alterações no nível de corticosterona ou monitorando o lado da gaiola, o que precisa ser explorado em pesquisas futuras. Outra limitação deste artigo é a ausência de métodos alternativos de coleta de sangue como controle. Comparações com outros métodos de coleta de sangue por suas vantagens e desvantagens serão abordadas em pesquisas futuras. Ao todo, este estudo introduz um método para coleta de sangue unipessoal de ratos sem a necessidade de anestesia. Essa abordagem oferece um meio simples, rápido e seguro de obter amostras de sangue de ratos.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Projeto Plano Cuiying do Lanzhou University Second Hospital (Grant No. PR0121015) e Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (Processo nº 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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Este mês em JoVE Edição 201 Rato veia subclávia coleta de sangueErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
