ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Her præsenterer vi en kombination af effektive rotterestriktioner og subklaviske venepunkturmetoder, der muliggør hurtig, sikker og gentagen blodindsamling hos rotter uden bedøvelse.
Abstract
Der er flere etablerede metoder til opnåelse af gentagne blodprøver fra rotter, hvor de mest almindeligt anvendte metoder er lateral haleveneprøveudtagning uden anæstesi og jugular veneprøveudtagning med anæstesi. Imidlertid kræver de fleste af disse metoder hjælp og bedøvelsesudstyr og udgør undertiden vanskeligheder med hensyn til blodindsamling eller den dårlige kvalitet af blodprøver. Desuden forbruger disse metoder til blodindsamling betydelig tid og menneskelige ressourcer, når gentagen blodprøvetagning er nødvendig for et stort antal rotter. Denne undersøgelse præsenterer en teknik til gentagen blodprøvetagning hos ikke-bedøvede rotter af et enkelt dygtigt individ. Meget tilfredsstillende blodprøver kan opnås ved at punktere den subklaviske vene. Metoden viste en imponerende samlet succesrate på 95%, med en mediantid på kun 2 minutter fra rottefastholdelse til afslutning af blodindsamling. Desuden påfører udførelse af på hinanden følgende blodsamlinger inden for det udpegede område ikke rotterne nogen skade. Denne metode er værd at fremme til blodindsamling, især i store farmakokinetiske undersøgelser.
Introduction
Rotter er et af de mest almindelige forsøgsdyr, og der er mange måder at få blodprøver på. Til forsøg, der involverer en enkelt blodindsamling i slutfasen, kan der opnås en tilstrækkelig mængde blod gennem hjertepunktur eller abdominal aorta blodindsamling1. Nogle undersøgelser kræver imidlertid gentagen blodindsamling fra rotter til rutinemæssig blod- eller biokemisk analyse, især i farmakokinetiske og toksikologiske undersøgelser, hvor gentagen blodindsamling er nødvendig for at bestemme absorption, distribution og metabolisme af lægemidler2.
I øjeblikket, selvom haleveneblodindsamling er den mest almindelige metode til blodprøvetagning fra rotter, på trods af at den ikke kræver anæstesi, kan denne metode være udfordrende for gentagne samlinger, og mængden af indsamlet blod er relativt lille 3,4. Derudover, selvom blod kan indsamles fra saphenøse og penisårer, er mængden af opnået blod begrænset, og anæstesi kræves 1,5. Desuden giver blodprøver indsamlet fra submandibulær venøs plexus såvel som sublinguelle, jugulære og subklaviske vener prøver af højere kvalitet, men kræver typisk anæstesi eller hjælp fra flere individer 1,6,7,8,9. Endelig kræver retro-orbital sinus / kanalblodindsamling ikke kun anæstesi, men kan også potentielt forårsage skade og stress på rotterne9.
Kvaliteten af blodprøver, der typisk opnås fra større vener, er generelt af højeste standard1. På nuværende tidspunkt har nogle undersøgelser vist, at kontinuerlig mikroprøveudtagning gennem halsvenen er en meget velegnet metode til toksikologisk forskning hos rotter, selvom denne metode normalt kræver jugular venekateterisering 10,11,12. Derfor er det værd at undersøge, hvordan man opnår blodprøver af høj kvalitet i overensstemmelse med 3R-princippet om dyreforsøg uden kirurgisk indgreb. Formålet med denne undersøgelse var at præsentere en metode til effektivt at ekstrahere blod fra den subklaviske vene hos rotter. Denne teknik muliggør hurtig indsamling af tilfredsstillende prøver gennem en enkeltpersons procedure uden behov for anæstesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse fulgte retningslinjerne i 8. udgave af vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr13. Forskningen modtog godkendelse fra den etiske komité på Lanzhou University Second Hospital og blev dokumenteret i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne 2.014. Tolv raske Wistar-rotter (seks hanner, der vejer 290-330 g og seks hunner, der vejer 250-280 g) i alderen 12-16 uger, blev indkvarteret i GLP Animal Laboratory ved Lanzhou University i 3 dage før selve forsøget. De anvendte rottebure var af typen R5, der målte 545 mm x 395 mm x 200 mm, og var udstyret med autoklaveret strøelse. Alle rotter fik ubegrænset adgang til både mad og vand. Laboratoriet opretholdt en gennemsnitlig luftfugtighed på 25%, en gennemsnitstemperatur på 24 °C og en lyscyklus, der skiftede mellem dag og nat (7:00 / 19:00). Ved afslutningen af undersøgelsen blev alle dyr humant aflivet ved hjælp af en overdosis isofluran. For omfattende information om de materialer og instrumenter, der anvendes i denne undersøgelse, henvises til materialefortegnelsen.
1. Beregning af stikprøvestørrelse og udvælgelse af dyr
- Vælg ressourceligningsmetode15 for at estimere dyreprøvens størrelse ved hjælp af ligning (1).
E = Samlet antal dyr − Samlet antal grupper (1)
Hvor E er graden af frihed til analyse af varians (ANOVA) og varierer fra 10 til 20.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 12 dyr opdelt i to grupper A og B (tre hanner og tre hunner pr. gruppe). - Definer det primære resultat af denne undersøgelse som succesraten og tidsforbruget af gentagen blodprøvetagning af et enkelt individ.
- Definer de sekundære resultatmål som ændringer i rotters kropsvægt, føde- og vandindtag samt forekomsten af bivirkninger (såsom kravebenfrakturer, subkutane hæmatomer, pneumothorax og dødelighed).
- Definer vellykket blodprøvetagning som opfylder følgende kriterier: i) færre end tre punkteringer for en enkelt blodindsamling; ii) en samlet tid (fra fastholdelse af rotter til afslutning af blodindsamlingen) på højst 5 minutter og iii) opnåelse af det målrettede blodvolumen, samtidig med at der opnås klart plasma. Betragt enhver afvigelse fra disse kriterier som en stikprøvefejl.
2. Fastholdelse af dyr og blodindsamling
OBS: Blodprøver fra gruppe A og B rotter blev indsamlet af to erfarne forskere, som begge havde taget mindst 100 blodprøver. Der blev taget blodprøver fra begge grupper af rotter i alt 96 gange i løbet af 4 dage. Denne blodindsamlingsmetode kræver ikke anæstesi eller yderligere fastholdelsesanordninger til rotterne. Det kræver dog dygtige håndteringsteknikker.
- Kl. 8:00 dagen før blodprøvetagning (dag 1) skal hver rotte tildeles sit individuelle bur, mens dens mad og vand vejes. Få derefter en anden forsker, blindet til målingerne, til at registrere rotternes vægt, fødeforbrug og vandindtag hver dag kl. 8:00 fra dag 1 og fremefter.
- For at følge denne protokol skal du først trække blod kl. 10:00 og derefter kl. 22:00 hver dag og indsamle 0,15 ml blod skiftevis fra de subklaviske vener på begge sider.
BEMÆRK: Mængden af blod, der skulle indsamles, blev bestemt af det maksimale volumen, som den lavest vægtige rotte kunne tåle inden for en uge. - Skyl en sprøjte med natriumheparin (25 E/ml) og desinficer injektionsstedet med alkohol.
- Strøg forsigtigt rottens ryghud og klem dens hals gentagne gange for at hjælpe rotten med at slappe af (video 1).
- Brug den ikke-dominerende hånds tommel- og pegefinger til at tage fat i og løfte rottens halshud fast (figur 1A og video 1).
- Med koordination fra den dominerende hånd skal du bruge de resterende tre fingre og håndfladen på den ikke-dominerende hånd til at sikre rottens ryghud og immobilisere dens forben (figur 1B, C og video 2).
BEMÆRK: Hvis rotten modstår eller kæmper, kan denne procedure gentages flere gange for at hjælpe rotten med at vænne sig til håndteringen. Følgende trin er nøglen til vellykket blodindsamling. - Brug den ikke-dominerende hånds pegefinger til forsigtigt at skubbe ned på rottens hovedhud, mens de andre fingre sammen med håndfladen hjælper med at rotere skulderleddet udad. Under denne proces skal du bruge den dominerende hånd til at strække rottens skulderled helt ud (figur 1D-F og video 2).
- Tag godt fat i rotten med den ikke-dominerende hånd for at justere rottens hoved og krop i en lige linje (figur 1G, H). Brug derefter den dominerende hånd til at lokalisere kravebenets position og bekræfte punkteringsstedet (figur 1I, video 2 og video 3).
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at barbere rotten. I figur 1 blev barberingen kun udført for at vise kravebenet og punkteringspositionen i større grad. Når man fastholder rotter, især rotter > 350 g, vil det hjælpe med at støtte deres kropsvægt, så rotten kan hvile fødderne på en fast overflade. Derudover skal fastholderen overvåge respirationsfrekvensen hos hver rotte, mens han samler blod for at sikre, at fastholdelsen ikke er for stram, hvilket kan forårsage åndedrætsbesvær. - Hold sprøjten parallelt med rottens krop i den dominerende hånd, med nålespidsen opad og sprøjteskalaen mod eksperimentatoren, og hold en vinkel på ca. 15° med midterlinjen af rottens krop. Indsæt nålen 0,5 cm under kravebenet (ved krydset mellem den proksimale tredjedel af kravebenet og brystbenet), og sørg for, at nålen forbliver parallel med rottens krop (figur 1J og video 3).
BEMÆRK: Der skal lægges særlig vægt på vinklen og dybden af kanyleindsættelsen for at undgå at gennembore blodkarret eller forårsage utilsigtet skade på tilstødende kar. - Træk forsigtigt sprøjten lidt ud for at skabe et undertryk, ofte ledsaget af en håndgribelig fornemmelse af gennembrud, når den kommer ind i blodkarret (især udtalt under den første blodindsamling). Oprethold denne position og opsaml 0,1-1,0 ml blod med en konstant hastighed efter behov (følg IACUC-retningslinjerne på ca. 4-5,3 ml / kg blod pr. uge1) (figur 1K og video 3).
- Hvis der ikke er blod ved punktering, skal du forsigtigt justere kanylens vinkel og dybde eller dreje sprøjten forsigtigt (video 3). Hvis tre på hinanden følgende forsøg på samme side ikke lykkes, skal du stoppe al blødning og derefter skifte til den modsatte side for punkteringen.
BEMÆRK: Hurtig punktering gennem huden er tilrådeligt for at forhindre rotten i at kæmpe på grund af ubehag. - Påfør en vatpind til hæmostase og returner rotten til sit bur (video 4).
- Behandl blodprøverne i henhold til de eksperimentelle krav.
3. Behandling af blodprøver
- Bortskaf kanylen i en kanyle til skarpe genstande. Overfør det opsamlede blod til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der tidligere er skyllet med heparin. Glasset anbringes i en centrifuge, indstilles til 4 °C og 1.200 x g, og centrifugeres i 10 minutter for at adskille plasmaet. Serummet overføres ved hjælp af en 1,0 ml Pasteur-pipette til et rent mikrocentrifugeglas og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: For at forhindre hæmolyse på grund af tryk skal nålespidsen fjernes, når det er nødvendigt. Under plasmaaspiration skal du undgå at trække blodlegemer fra bunden af røret. Lejlighedsvis kan sprøjtens overflade samle rottepels; Pas på ikke at lade pels komme ind i røret, da det kan føre til koagulation.
4. Statistisk analyse
- Præsenter alle data som middelværdi ± standardafvigelse, og test dem for varianshomogenitet.
- Brug Fishers nøjagtige test til at sammenligne succesraterne mellem grupper.
- Brug en uafhængig t-test med to stikprøver til at sammenligne det samlede gennemsnit mellem de to grupper.
- Brug variansanalyse (ANOVA) til kontinuerlige målinger såsom blodprøvetagningstid, kropsvægt, fødeindtagelse og vandforbrug. Overvej P < 0,05 statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Højkvalitets plasmaprøver udviser en lysegul nuance, klarhed og gennemsigtighed, uden rødt skær eller koagulation, som afbildet i figur 2A. Figur 2B viser hæmolyse (venstre side) eller koagulation (højre side) som følge af henholdsvis ukorrekte procedurer. I løbet af 96 blodindsamlingssessioner inden for 4 dage var de gennemsnitlige enkeltblodindsamlingstider for gruppe A og B henholdsvis 119,87 ± 33,62 s og 123,28 ± 30,96 s. Der var ingen signifikant forskel i blodindsamlingstiderne mellem de to grupper på daglig basis (t = 0,66, P = 0,54, tabel 1). De korteste individuelle blodindsamlingstider var henholdsvis 78 s og 89 s.
Det gennemsnitlige antal forsøg, der kræves for en vellykket enkelt blodindsamling, var 1,21 og 1,17 for henholdsvis gruppe A og B. Der var ingen signifikant forskel i antallet af forsøg mellem de to grupper (t = 0,58, P = 0,60, tabel 2). De samlede succesrater var 93,8% (45/48) og 95,8% (46/48) for henholdsvis gruppe A og B, uden nogen signifikant forskel i de samlede succesrater mellem de to grupper (P > 0,05, tabel 1). Der var ingen signifikant forskel i tidspunktet for blodindsamling i gruppe B på hvert tidspunkt. I gruppe A var blodindsamlingstiden på den anden dag mindre end den på den fjerde dag (105,75 ± 14,22s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabel 1) . Derudover indikerer flere forsøg og længere punkteringstider ofte højere fejlrater (figur 3A-C). På den tredje dag stødte gruppe B på en fejl, der tilskrives hæmolyse. På den fjerde dag stødte gruppe A på tre fejl: en på grund af hæmolyse og de to andre på grund af manglende evne til at få blodprøver. Gruppe B oplevede også en fejl på grund af manglende evne til at få en blodprøve.
I løbet af 4 på hinanden følgende dages observation viste begge grupper af rotter stabil vægtøgning. Vand- og fødeindtag forblev relativt konstant blandt rotter af samme køn. Gennem hele blodindsamlingsprocessen var der ingen tilfælde af rottedødelighed, og der blev heller ikke observeret nogen signifikante komplikationer, såsom kravebensfrakturer, pneumothorax eller punkteringsstedshæmatomer (figur 3D-F og tabel 3).
Figur 1: Fikserings- og blodindsamlingsmetoder for den subklaviske vene hos rotter. (A-H) Manipulation af fiksering; I) placering af kravebenet og blodindsamlingsstedet (J-L) processen med blodindsamling og hæmostase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vellykket og forgæves indsamlede blodprøver. (A) Typiske blodprøver og isoleret plasma; (B) hæmolyserede (venstre) og koagulerede (højre) blodprøver Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af effektiviteten og sikkerheden ved blodtapning. (A) Gennemsnitlig tid for blodindsamling pr. dag; B) gennemsnitligt antal punkteringer pr. dag C) succesraten og fejlraten for tapning af blod i begge grupper (D-F) ændringer i kropsvægt, fødeindtagelse og vandindtag under blodindsamling hos begge grupper af rotter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Anatomi af rottehalskar. A) Overfladiske anatomiske strukturer B) dybe anatomiske strukturer. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gruppe | Tidspunkt | Gennemsnitlig blodindsamlingstid (e) | |||
| Dag 1 | Dag 2* | Dag 3 | Dag 4 | ||
| En | 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108,67 ± 10,86 | 111.00 ± 6.95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Gennemsnitlig tid | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Succesrate | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Samlet succesrate | 93.8% (45/48) | ||||
| Samlet gennemsnitlig tid | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126,67 ± 17,12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Gennemsnitlig tid | 102.08 ± 12.02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Succesrate | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Samlet succesrate | 95.8% (46/48) | ||||
| Samlet gennemsnitlig tid | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabel 1: Blodindsamlingstider og succesrater for de to grupper rotter. *Blodindsamlingstiden på den anden dag var mindre end på den fjerde dag i gruppe A (t = 12,39 P < 0,01).
| Gruppe | Tidspunkt | Gennemsnitligt antal punkteringer | |||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| En | 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Gennemsnitlig | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Samlet gennemsnit | 1.21 | ||||
| B | 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Gennemsnitlig | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Samlet gennemsnit | 1.17 | ||||
Tabel 2: Gennemsnitligt antal punkteringer for blodtapning hos rotter.
| Køn | Gruppe | Vægt (g) | Fødeindtagelse (g) | Vandindtag (g) | |||||||||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| ♀ | En | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24.1 ± 1.79 | |
| t/q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Justeret P-værdi | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | En | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Justeret P-værdi | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabel 3: Ændringer i daglig kropsvægt, fødeindtagelse og vandindtag hos rotter.
Video 1: Beroligende og håndtering af rotter. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Fastholdelsesprocedurer for rotter. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Blodindsamlingsproceduren for rotter. Klik her for at downloade denne video.
Video 4: Hæmostatisk kompression på punkteringsstedet. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom haleveneblodindsamling er den mest almindelige metode til gentagen blodprøvetagning hos rotter, kan den påvirkes af anæstesilægemidler, og på grund af halevenens lille størrelse er mængden af blod, der kan indsamles i et enkelt tilfælde, begrænset, hvilket fører til en længere blodindsamlingsvarighed 4,5. Selvom højtydende væskekromatografi (HPLC) -tandem massespektrometri (MS / MS) systemer kombineret med kapillær mikroprøveudtagning (CMS) af rottehaleårer kan reducere mængden af blod, der anvendes til rotter11, er ikke alle institutioner udstyret med dette dyre udstyr. Blodprøvetagning fra retrobulbar plexus / sinus forårsager ofte angst og smerte hos rotter, og forkert drift kan endda skade rotters syn og sundhed. Derfor anbefales denne metode ikke til blodprøvetagning hos rotter9.
Den subklaviske vene er placeret mellem rottens pectoralis major og deltoidmuskel og dræner ind i halsvenen ved en tredjedel af det indre kraveben (figur 4). I undersøgelsen af Yang et al. var succesraten for blodindsamling fra den subklaviske vene hos rotter under anæstesi ca. 90% af en dygtig operatør, hvis minimumstid fra starten til slutningen af punkteringen var 65 s7. I Wang et al.'s undersøgelse blev blodprøver indsamlet fra rottens subklaviske vene ved hjælp af en lodret tilgang. Selvom deres metode ikke involverede anæstesi, krævede det samarbejde mellem to personer for sikkert at begrænse rotten6. Denne undersøgelsesprotokol viser en god fordel ved blodindsamling. Denne protokol kræver ingen særlige fastholdelsesanordninger eller anæstesifaciliteter. Ved korrekt håndtering udviser rotter generelt minimal modstand. Mediantiden fra rottefastholdelse til afslutning af blodtapning var kun 2 min, hvilket opnåede en imponerende samlet succesrate på 95%. Denne metode sparer betydeligt menneskelige ressourcer og reducerer den tid, der kræves til blodindsamling. Endvidere er de opnåede plasmaprøver klare og gennemsigtige med minimal forekomst af hæmolyse og koagulationshændelser, hvilket minimerer eksperimentgentagelse. Færdigheder i denne teknik er særligt værdifulde til styring af storskala rottefarmakokinetik og toksikologiske eksperimenter, der kræver gentagen blodindsamling.
I vores undersøgelse var den vigtigste forekomst af blodtrækningssvigt på dag 4, hvilket kan være relateret til venøs skade forårsaget af gentagne punkteringer. Gentagne punkteringer kan føre til beskadigelse af vaskulærvæggen og fremkalde et inflammatorisk respons, hvilket får vaskulærvæggen til at blive tykkere og hærde og endda fremkalde vaskulær indsnævring. Hvis hæmostase er utilstrækkelig efter punktering, kan det ekstravaserede blod yderligere forårsage vævsødem og betændelse, hvilket efterfølgende fører til dannelse af arvæv. Disse arvæv er svære at trænge ind i og kan også trække og få blodkarrene til at skifte position, hvilket alt sammen gør blodkarrene vanskeligere at lokalisere og punktere. I vores undersøgelse blev en 26G sprøjte (0,45 mm) brugt til blodindsamling, hvilket er fint i forhold til menneskelige vener, men stadig forårsager betydelig skade på rotteårer. Dette fremgår af den klare følelse af penetration, når nålen passerer gennem karret under den første blodtrækning, hvilket mindskes, når antallet af blodudtrækninger stiger, med længere blodindsamlingstider og højere fejlrater. Derfor anbefaler vi at bruge en finere insulinnål til blodindsamling, og der skal påføres tilstrækkeligt tryk efter blodindsamling for at forhindre dannelse af hæmatom, og alternative blodudtrækninger bør udføres for at muliggøre tilstrækkelig venøs reparation. Efter vores erfaring kan en veluddannet flebotomist bruge en 26G-nål til skiftevis at trække blod fra de bilaterale subklaviske vener hos den samme rotte 8-10 gange inden for 24 timer med et gennemsnitligt interval på 2-3 timer mellem hver blodtrækning. Imidlertid kan det maksimale antal blodtræk, som en rotte kan tolerere, restitutionsperioden og blodtrækningscyklussen påvirkes af den anvendte nålemåler, de blodtrækningsintervaller, der kræves af forskellige eksperimenter, og phlebotomistens færdigheder. Disse faktorer skal undersøges nærmere i fremtidig forskning. For intensiv blodprøvetagning, der kræves til farmakokinetiske forsøg, er det bedre at skiftevis indsamle blod fra venstre og højre subklaviske vener. I tilfælde, hvor det virkelig ikke er tilgængeligt, kan andre metoder til blodindsamling suppleres.
Kropsvægt, vandforbrug og fødeindtagelse er de mest grundlæggende og enkle indikatorer til vurdering af rotters sundhedstilstand16. En tidlig undersøgelse havde vist, at blodindsamling via halsvenen på mindre end 0,9 ml pr. Dag ikke påvirkede hæmodynamikken hos rotter og ikke resulterede i noget signifikant vægttab. Men når blodindsamlingen overstiger 1,5 ml, kan det føre til vægttab17. I undersøgelsen af Yokoya et al. påvirkede gentagen mikrosampling fra halsvenen (50 μL hver gang, 6-7x inden for 24 timer) ikke rottens kropsvægt eller fødeindtagelse10. Desuden kan blodindsamlingsmåden påvirke kropsvægt og fødeindtagelse hos rotter. I en tidligere undersøgelse ved hjælp af sublingual veneblodindsamling resulterede en 24 timers samling af 0,5-1,0 ml blod på den første dag i en reduktion i rottens kropsvægt og nedsat fødeindtagelse, selvom vægttabet ikke var signifikant18. I denne undersøgelse steg rotternes kropsvægt stadig støt i blodindsamlingsperioden, og der var ingen signifikante ændringer i føde- og vandindtagelse, blodindsamlingsrelaterede komplikationer og rotternes død, hvilket indikerer, at denne metode er sikker og pålidelig.
Det er afgørende at understrege, at akklimatisering af rotterne til fastholdelsesprocessen inden blodindsamling sandsynligvis vil mindske stress hos rotten og forbedre succesraten for blodindsamlingen. Utilstrækkelig fiksering og utilstrækkelig veneeksponering kan føre til blodindsamlingsfejl og endda forårsage lokal venebrud på grund af rotternes kamp i smerte. I mildere tilfælde kan dette resultere i mærkbare subkutane hæmatomer, mens det i alvorlige tilfælde kan føre til rottedød. Desuden kan dårlig fiksering føre til, at rotter undslipper og forårsager skade på enkeltpersoner. Derfor anbefaler vi kraftigt, at du mestrer håndteringsteknikken grundigt, inden du fortsætter med blodindsamlingsproceduren. Desuden er det vigtigt at være forsigtig med den kraft, der påføres for udadgående rotation af skulderleddet, da for stort tryk kan føre til kravebensbrud hos rotten.
En begrænsning ved denne undersøgelse er, at vi ikke systematisk evaluerede ændringerne i stress induceret af denne blodindsamlingsmetode hos rotter ved at måle ændringerne i kortikosteronniveauet eller ved overvågning på bursiden, hvilket skal undersøges i fremtidig forskning. En anden begrænsning af denne artikel er fraværet af alternative blodindsamlingsmetoder som kontrol. Sammenligninger med andre blodindsamlingsmetoder for deres fordele og ulemper vil blive behandlet i fremtidig forskning. I alt introducerer denne undersøgelse en metode til enkeltpersons blodindsamling fra rotter uden behov for anæstesi. Denne tilgang giver en ligetil, hurtig og sikker måde at få blodprøver fra rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante økonomiske eller ikke-finansielle interesser at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Cuiying Plan Project fra Lanzhou University Second Hospital (bevilling nr. PR0121015) og Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (bevilling nr. 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
Denne måned i JoVE udgave 201 rotte subklavisk vene blodprøvetagningErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
