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Summary
Nous présentons ici une combinaison de méthodes efficaces de restriction chez le rat et de ponction veineuse sous-clavière qui permettent une collecte de sang rapide, sûre et répétée chez le rat sans anesthésie.
Abstract
Il existe plusieurs méthodes établies pour obtenir des échantillons de sang répétés de rats, les méthodes les plus couramment utilisées étant le prélèvement latéral de la veine caudale sans anesthésie et le prélèvement de la veine jugulaire sous anesthésie. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessitent une assistance et un matériel anesthésique et posent parfois des difficultés en termes de prélèvement sanguin ou de mauvaise qualité des prélèvements sanguins. De plus, ces méthodes de prélèvement sanguin consomment beaucoup de temps et de ressources humaines lorsque des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires pour un grand nombre de rats. Cette étude présente une technique de prélèvement sanguin répétitif chez des rats non anesthésiés par un seul individu compétent. Des échantillons de sang très satisfaisants peuvent être obtenus en ponctionnant la veine sous-clavière. La méthode a démontré un taux de réussite global impressionnant de 95 %, avec un temps médian de seulement 2 minutes entre la contention du rat et la fin de la collecte de sang. De plus, le fait d’effectuer des prélèvements sanguins consécutifs dans la plage désignée n’inflige aucun dommage aux rats. Cette méthode mérite d’être encouragée pour la collecte de sang, en particulier dans les études pharmacocinétiques à grande échelle.
Introduction
Les rats sont l’un des animaux de laboratoire les plus courants, et il existe de nombreuses façons d’obtenir des échantillons de sang. Pour les expériences impliquant un seul prélèvement sanguin au stade final, une quantité suffisante de sang peut être obtenue par ponction cardiaque ou prélèvement sanguin de l’aorte abdominale1. Cependant, certaines études nécessitent des prélèvements sanguins répétés sur des rats pour des analyses sanguines ou biochimiques de routine, en particulier dans les études de pharmacocinétique et de toxicologie, où des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires pour déterminer l’absorption, la distribution et le métabolisme des médicaments2.
À l’heure actuelle, bien que le prélèvement sanguin dans les veines caudales soit la méthode la plus courante pour le prélèvement sanguin chez les rats, bien qu’elle ne nécessite pas d’anesthésie, cette méthode peut être difficile pour les prélèvements répétés, et le volume de sang prélevé est relativement faible 3,4. De plus, bien que le sang puisse être prélevé dans les veines saphènes et péniennes, la quantité de sang obtenue est limitée et une anesthésie est nécessaire 1,5. De plus, les échantillons de sang prélevés dans le plexus veineux sous-maxillaire, ainsi que dans les veines sublinguales, jugulaires et sous-clavières fournissent des échantillons de meilleure qualité, mais nécessitent généralement une anesthésie ou l’assistance de plusieurs personnes 1,6,7,8,9. Enfin, le prélèvement sanguin des sinus et des canaux rétro-orbitaires nécessite non seulement une anesthésie, mais peut également causer des blessures et du stress aux rats9.
La qualité des échantillons de sang généralement obtenus à partir des principales veines est généralement de la plus haute qualité1. À l’heure actuelle, certaines études ont montré que le microéchantillonnage continu à travers la veine jugulaire est une méthode très appropriée pour la recherche toxicologique chez le rat, bien que cette méthode nécessite généralement un cathétérisme de la veine jugulaire 10,11,12. Par conséquent, il vaut la peine d’explorer comment obtenir des échantillons de sang de haute qualité conformément au principe des 3R de la recherche animale sans intervention chirurgicale. L’objectif de cette étude était de présenter une méthode permettant d’extraire efficacement le sang de la veine sous-clavière chez le rat. Cette technique permet de prélever rapidement des échantillons satisfaisants par le biais d’une procédure par une seule personne sans avoir besoin d’anesthésie.
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Protocol
Cette étude a respecté les lignes directrices énoncées dans la 8e édition du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire13. La recherche a reçu l’approbation du comité d’éthique du deuxième hôpital de l’Université de Lanzhou et a été documentée conformément aux directives ARRIVE 2.014. Douze rats Wistar en bonne santé (six mâles pesant entre 290 et 330 g et six femelles pesant entre 250 et 280 g) âgés de 12 à 16 semaines ont été hébergés dans le laboratoire animalier BPL de l’Université de Lanzhou pendant 3 jours avant l’expérience proprement dite. Les cages à rats utilisées étaient de type R5, mesurant 545 mm x 395 mm x 200 mm, et étaient équipées d’une litière autoclave. Tous les rats ont eu un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Le laboratoire a maintenu une humidité moyenne de 25%, une température moyenne de 24 °C et un cycle de lumière alternant entre le jour et la nuit (7h00/19h00). À la fin de l’étude, tous les animaux ont été euthanasiés sans cruauté à l’aide d’une surdose d’isoflurane. Pour obtenir des renseignements complets sur les matériaux et les instruments utilisés dans cette étude, veuillez consulter le tableau des matériaux.
1. Calcul de la taille de l’échantillon et sélection des animaux
- Choisissez la méthode15 de l’équation des ressources pour estimer la taille de l’échantillon d’animaux à l’aide de l’équation (1).
E = Nombre total d’animaux − Nombre total de groupes (1)
Où E est le degré de liberté d’analyse de la variance (ANOVA) et est compris entre 10 et 20.
REMARQUE : Dans cette étude, 12 animaux ont été divisés en deux groupes A et B (trois mâles et trois femelles par groupe). - Définissez le critère de jugement principal de cette étude comme le taux de réussite et le temps nécessaire à des prélèvements sanguins répétés par un seul individu.
- Définissez les critères de jugement secondaires comme les changements dans le poids corporel du rat, la consommation de nourriture et d’eau, ainsi que l’incidence des événements indésirables (tels que les fractures de la clavicule, les hématomes sous-cutanés, le pneumothorax et la mortalité).
- Définir la réussite de l’échantillonnage sanguin comme répondant aux critères suivants : i) moins de trois ponctions pour un seul prélèvement sanguin ; ii) un temps total (de la contention des rats à la fin du prélèvement sanguin) n’excédant pas 5 minutes ; et iii) atteindre le volume sanguin ciblé tout en obtenant du plasma clair. Considérez tout écart par rapport à ces critères comme un échec d’échantillonnage.
2. Contention des animaux et prélèvement sanguin
REMARQUE : Des échantillons de sang de rats des groupes A et B ont été prélevés par deux chercheurs expérimentés, qui avaient tous deux prélevé au moins 100 échantillons de sang. Des échantillons de sang ont été prélevés sur les deux groupes de rats pour un total de 96 fois sur une période de 4 jours. Cette méthode de prélèvement sanguin ne nécessite pas d’anesthésie ou de dispositifs de contention supplémentaires pour les rats. Cependant, cela nécessite des techniques de manipulation habiles.
- À 8h00 la veille de la prise de sang (jour 1), assignez chaque rat à sa cage individuelle pendant que sa nourriture et son eau sont pesées. Ensuite, demandez à un autre chercheur, aveugle aux mesures, d’enregistrer le poids, la consommation de nourriture et la consommation d’eau des rats tous les jours à 8h00 à partir du jour 1.
- Pour suivre ce protocole, faites d’abord une prise de sang à 10h00, puis à 22h00 chaque jour, en prélevant 0,15 mL de sang alternativement dans les veines sous-clavières des deux côtés.
REMARQUE : La quantité de sang à prélever a été déterminée par le volume maximal que le rat de poids le plus faible pouvait tolérer en une semaine. - Rincer une seringue avec de l’héparine de sodium (25 U/mL) et désinfecter le site d’injection avec de l’alcool.
- Caressez doucement la peau du dos du rat et pincez son cou à plusieurs reprises pour l’aider à se détendre (vidéo 1).
- À l’aide du pouce et de l’index de la main non dominante, saisissez et soulevez fermement la peau du cou du rat (figure 1A et vidéo 1).
- Avec la coordination de la main dominante, utilisez les trois doigts restants et la paume de la main non dominante pour fixer la peau du dos du rat et immobiliser ses membres avant (Figure 1B, C et vidéo 2).
REMARQUE : Si le rat résiste ou se débat, cette procédure peut être répétée plusieurs fois pour aider le rat à s’habituer à la manipulation. Les étapes suivantes sont essentielles à la réussite de la collecte de sang. - À l’aide de l’index de la main non dominante, appuyez doucement sur la peau de la tête du rat tandis que les autres doigts, ainsi que la paume, aident à faire pivoter l’articulation de l’épaule vers l’extérieur. Au cours de ce processus, utilisez la main dominante pour étendre complètement l’articulation de l’épaule du rat (Figure 1D-F et vidéo 2).
- Saisissez fermement le rat avec la main non dominante pour aligner la tête et le corps du rat en ligne droite (Figure 1G,H). Ensuite, utilisez la main dominante pour localiser la position de la clavicule et confirmez le site de ponction (Figure 1I, Vidéo 2 et Vidéo 3).
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de raser le rat. Dans la figure 1, le rasage n’a été effectué que pour montrer la position de la clavicule et de la ponction dans une plus grande mesure. Lorsque vous retenez les rats, en particulier les rats >350 g, le fait de permettre au rat de reposer ses pattes sur une surface solide aidera à supporter le poids de son corps. De plus, le dispositif de contention doit surveiller la fréquence respiratoire de chaque rat pendant la collecte de sang pour s’assurer que la contention n’est pas trop serrée, ce qui pourrait causer une détresse respiratoire. - En tenant la seringue parallèle au corps du rat dans la main dominante, avec la pointe de l’aiguille vers le haut et l’échelle de la seringue vers l’expérimentateur, maintenez un angle d’environ 15° avec la ligne médiane du corps du rat. Insérez l’aiguille à 0,5 cm sous l’encoche de la clavicule (à la jonction du tiers proximal de la clavicule et du sternum), en veillant à ce que l’aiguille reste parallèle au corps du rat (Figure 1J et Vidéo 3).
REMARQUE : Une attention particulière doit être portée à l’angle et à la profondeur de l’insertion de l’aiguille pour éviter de percer le vaisseau sanguin ou de causer des dommages involontaires aux vaisseaux adjacents. - Retirez légèrement la seringue pour créer une pression négative, souvent accompagnée d’une sensation palpable de percée à l’entrée dans le vaisseau sanguin (particulièrement prononcée lors de la prise de sang initiale). Maintenez cette position et prélevez de 0,1 à 1,0 mL de sang à une vitesse constante au besoin (en suivant les directives de l’IACUC d’environ 4 à 5,3 mL/kg de sang par semaine1) (Figure 1K et Vidéo 3).
- S’il n’y a pas de sang lors de la ponction, essayez d’ajuster doucement l’angle et la profondeur de l’aiguille ou faites pivoter doucement la seringue (vidéo 3). Si trois tentatives consécutives du même côté sont infructueuses, arrêtez toute hémorragie, puis passez du côté opposé pour la ponction.
REMARQUE : Une ponction rapide à travers la peau est conseillée pour éviter que le rat ne se débatte en raison de l’inconfort. - Appliquez un coton-tige pour l’hémostase et remettez le rat dans sa cage (vidéo 4).
- Traiter les échantillons de sang conformément aux exigences expérimentales.
3. Traitement des échantillons de sang
- Jetez l’aiguille de la seringue dans un récipient pour objets tranchants. Transférez le sang recueilli dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL préalablement rincé à l’héparine. Placez le tube dans une centrifugeuse, en le réglant à 4 °C et 1 200 x g, et centrifugez pendant 10 minutes pour séparer le plasma. Transférez le sérum à l’aide d’une pipette Pasteur de 1,0 ml dans un tube de microcentrifugation propre et conservez-le à -80 °C.
REMARQUE : Pour éviter l’hémolyse due à la pression, retirez la pointe de l’aiguille si nécessaire. Lors de la ponction plasmatique, évitez de prélever des cellules sanguines au fond du tube. Parfois, la surface de la seringue peut recueillir de la fourrure de rat ; Veillez à ne pas laisser de fourrure pénétrer dans le tube, car cela peut entraîner la coagulation.
4. Analyse statistique
- Présentez toutes les données sous forme de moyenne ±écart-type et testez-les pour vérifier l’homogénéité de la variance.
- Utilisez le test exact de Fisher pour comparer les taux de réussite entre les groupes.
- Utilisez un test t indépendant à deux échantillons pour comparer les moyennes globales entre les deux groupes.
- Utilisez l’analyse de variance (ANOVA) pour des mesures continues telles que le temps de prélèvement sanguin, le poids corporel, l’apport alimentaire et la consommation d’eau. Considérons que P < 0,05 est statistiquement significatif.
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Representative Results
Les échantillons de plasma de haute qualité présentent une teinte, une clarté et une transparence jaune pâle, dépourvues de toute teinte rouge ou coagulation, comme le montre la figure 2A. La figure 2B montre l’hémolyse (côté gauche) ou la coagulation (côté droit) à la suite de procédures inappropriées, respectivement. Au cours de 96 séances de prélèvement sanguin en 4 jours, les temps moyens de prélèvement sanguin pour les groupes A et B étaient respectivement de 119,87 ± 33,62 s et de 123,28 ± 30,96 s. Il n’y avait pas de différence significative dans les temps de prélèvement sanguin entre les deux groupes sur une base quotidienne (t = 0,66, P = 0,54, tableau 1). Les temps de prélèvement sanguin individuels les plus courts étaient respectivement de 78 s et 89 s.
Le nombre moyen de tentatives nécessaires pour une collecte de sang unique réussie était de 1,21 et 1,17 pour les groupes A et B, respectivement. Il n’y avait pas de différence significative dans le nombre de tentatives entre les deux groupes (t = 0,58, p = 0,60, tableau 2). Les taux de réussite globaux étaient de 93,8 % (45/48) et de 95,8 % (46/48) pour les groupes A et B, respectivement, sans différence significative dans les taux de réussite globaux entre les deux groupes (P > 0,05, tableau 1). Il n’y avait pas de différence significative dans l’heure du prélèvement sanguin dans le groupe B à chaque moment donné. Dans le groupe A, le temps de prélèvement sanguin du deuxième jour était inférieur à celui du quatrième jour (105,75 ± 14,22 s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01 ; Tableau 1) . De plus, un plus grand nombre de tentatives et des temps de perforation plus longs indiquent souvent des taux d’échec plus élevés (figure 3A-C). Le troisième jour, le groupe B a rencontré une défaillance attribuée à l’hémolyse. Le quatrième jour, le groupe A a rencontré trois échecs : l’un dû à l’hémolyse et les deux autres à l’impossibilité d’obtenir des échantillons de sang. Le groupe B a également connu un échec en raison de l’impossibilité d’obtenir un échantillon de sang.
Au cours de 4 jours consécutifs d’observation, les deux groupes de rats ont montré un gain de poids constant. La consommation d’eau et de nourriture est demeurée relativement constante chez les rats du même sexe. Tout au long du processus de collecte de sang, il n’y a eu aucun cas de mortalité chez le rat, et aucune complication significative n’a été observée, comme des fractures de la clavicule, un pneumothorax ou des hématomes au site de ponction (Figure 3D-F et Tableau 3).
Figure 1 : Méthodes de fixation et de prélèvement sanguin de la veine sous-clavière chez le rat. (A-H) Manipulation de la fixation ; (I) l’emplacement de la clavicule et du lieu de prélèvement sanguin ; (J-L) le processus de prélèvement sanguin et d’hémostase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Échantillons de sang prélevés avec succès et sans succès. (A) Échantillons de sang typiques et plasma isolé ; (B) échantillons de sang hémolysé (à gauche) et coagulé (à droite) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de l’efficacité et de l’innocuité du prélèvement sanguin. (A) Durée moyenne du prélèvement sanguin par jour ; (B) le nombre moyen de crevaisons par jour ; (C) les taux de réussite et d’échec de la collecte de sang dans les deux groupes ; (D-F) changements dans le poids corporel, l’apport alimentaire et l’apport en eau pendant le prélèvement sanguin chez les deux groupes de rats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Anatomie des vaisseaux du col du rat. (A) Structures anatomiques superficielles ; (B) les structures anatomiques profondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Groupe | Heure | Temps moyen de prélèvement sanguin (s) | |||
| Jour 1 | Jour 2* | Jour 3 | Jour 4 | ||
| Un | 10 :00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22 :00 | 108,67 ± 10,86 | 111.00 ± 6.95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Temps moyen | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Taux de réussite | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Taux de réussite global | 93.8% (45/48) | ||||
| Temps moyen global | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10 :00 | 98,17 ± 7,24 | 110,17 ± 14,33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22 :00 | 106,00 ± 14,35 | 126,67 ± 17,12 | 123,17 ± 17,50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Temps moyen | 102,08 ± 12,02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Taux de réussite | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Taux de réussite global | 95.8% (46/48) | ||||
| Temps moyen global | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tableau 1 : Temps de prélèvement sanguin et taux de réussite des deux groupes de rats. *Le temps de prélèvement sanguin du deuxième jour était inférieur à celui du quatrième jour dans le groupe A (t = 12,39 P < 0,01).
| Groupe | Heure | Nombre moyen de crevaisons | |||
| Jour 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | ||
| Un | 10 :00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22 :00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Moyenne | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Moyenne générale | 1.21 | ||||
| B | 10 :00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22 :00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Moyenne | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Moyenne générale | 1.17 | ||||
Tableau 2 : Nombre moyen de ponctions pour le prélèvement sanguin chez le rat.
| Genre | Groupe | Poids (g) | Apport alimentaire (g) | Prise d’eau (g) | |||||||||
| Jour 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | Jour 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | Jour 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | ||
| ♀ | Un | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5,4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| T/Q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Valeur P ajustée | >0,99 € | >0,99 € | >0,99 € | >0,99 € | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 € | >0,99 € | >0,99 € | >0,99 € | |
| ♂ | Un | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25,3 ± 1,1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Valeur P ajustée | 0.94 | 0.86 | >0,99 € | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tableau 3 : Changements dans le poids corporel quotidien, l’apport alimentaire et la consommation d’eau des rats.
Vidéo 1 : Calmer et manipuler les rats. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Procédures de contention pour les rats. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : La procédure de prélèvement sanguin chez les rats. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 4 : Compression hémostatique au site de ponction. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Bien que le prélèvement sanguin dans la veine caudale soit la méthode la plus courante pour les prélèvements sanguins répétés chez le rat, elle peut être influencée par les médicaments anesthésiques et, en raison de la petite taille de la veine caudale, la quantité de sang qui peut être prélevée en une seule fois est limitée, ce qui entraîne une durée de prélèvement sanguin plus longue 4,5. Bien que les systèmes de chromatographie liquide (HPLC) et de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) à haute performance combinés à un microéchantillonnage capillaire (CMS) des veines de la queue de rat puissent réduire la quantité de sang utilisée chez les rats11, tous les établissements ne sont pas équipés de cet équipement coûteux. Les prélèvements sanguins du plexus rétrobulbaire et des sinus provoquent souvent de l’anxiété et de la douleur chez les rats, et une mauvaise utilisation peut même nuire à la vision et à la santé des rats. Par conséquent, cette méthode n’est pas recommandée pour les prélèvements sanguins chez le rat9.
La veine sous-clavière est située entre le muscle grand pectoral et le muscle deltoïde du rat et s’écoule dans la veine jugulaire au tiers de la clavicule interne (Figure 4). Dans l’étude de Yang et al., le taux de réussite du prélèvement sanguin de la veine sous-clavière chez les rats sous anesthésie était d’environ 90% par un opérateur qualifié, dont le temps minimum entre le début et la fin de la ponction était de 65 s7. Dans l’étude de Wang et al., des échantillons de sang ont été prélevés dans la veine sous-clavière du rat en utilisant une approche verticale. Bien que leur méthode n’impliquait pas d’anesthésie, elle nécessitait la collaboration de deux personnes pour restreindre solidement le rat6. Ce protocole d’étude montre un bon avantage de la prise de sang. Ce protocole ne nécessite pas de dispositifs de contention spéciaux ni d’installation d’anesthésie. Avec une manipulation appropriée, les rats présentent généralement une résistance minimale. Le temps médian entre la contention des rats et la fin de la collecte de sang n’était que de 2 minutes, ce qui a permis d’obtenir un taux de réussite global impressionnant de 95 %. Cette méthode permet de préserver considérablement les ressources humaines et de réduire le temps nécessaire à la collecte de sang. De plus, les échantillons de plasma obtenus sont clairs et transparents, avec une occurrence minimale d’hémolyse et d’événements de coagulation, minimisant ainsi la répétition de l’expérience. La maîtrise de cette technique est particulièrement précieuse pour la gestion d’expériences de pharmacocinétique et de toxicologie à grande échelle chez le rat nécessitant des prélèvements sanguins répétitifs.
Dans notre étude, la principale occurrence d’échec de la prise de sang était le jour 4, ce qui pourrait être lié aux lésions veineuses causées par des ponctions répétées. Des ponctions répétées peuvent endommager la paroi vasculaire et provoquer une réponse inflammatoire, provoquant l’épaississement et le durcissement de la paroi vasculaire, voire un rétrécissement vasculaire. Si l’hémostase est inadéquate après la ponction, le sang extravasé peut provoquer un œdème tissulaire et une inflammation, entraînant par la suite la formation de tissu cicatriciel. Ces tissus cicatriciels sont difficiles à pénétrer et peuvent également tirer et provoquer un changement de position des vaisseaux sanguins, ce qui rend les vaisseaux sanguins plus difficiles à localiser et à percer. Dans notre étude, une seringue de 26 G (0,45 mm) a été utilisée pour le prélèvement sanguin, ce qui est bien par rapport aux veines humaines, mais cause tout de même des dommages considérables aux veines des rats. Ceci est mis en évidence par la nette sensation de pénétration lorsque l’aiguille passe à travers le vaisseau lors de la première prise de sang, qui diminue à mesure que le nombre de prises de sang augmente, avec des temps de prélèvement sanguin plus longs et des taux d’échec plus élevés. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser une aiguille à insuline plus fine pour le prélèvement sanguin, et une pression adéquate doit être appliquée après le prélèvement sanguin pour éviter la formation d’hématome, et des prélèvements sanguins alternatifs doivent être effectués pour permettre une réparation veineuse suffisante. D’après notre expérience, un phlébotomiste bien entraîné peut utiliser une aiguille 26G pour prélever alternativement du sang dans les veines sous-clavières bilatérales du même rat 8 à 10 fois en 24 heures, avec un intervalle moyen de 2 à 3 heures entre chaque prise de sang. Cependant, le nombre maximal de prélèvements sanguins qu’un rat peut tolérer, la période de récupération et le cycle de prélèvement sanguin peuvent être influencés par la jauge d’aiguille utilisée, les intervalles de prélèvement sanguin requis par différentes expériences et la compétence du phlébotomiste. Ces facteurs doivent être explorés plus en détail dans les recherches futures. Pour les prélèvements sanguins intensifs nécessaires aux expériences de pharmacocinétique, il est préférable de prélever alternativement du sang dans les veines sous-clavières gauche et droite. Dans les cas où il n’est vraiment pas disponible, d’autres méthodes de prélèvement sanguin peuvent être complétées.
Le poids corporel, la consommation d’eau et l’apport alimentaire sont les indicateurs les plus élémentaires et les plus simples pour évaluer l’état de santé des rats16. Une première étude avait montré que le prélèvement sanguin par la veine jugulaire de moins de 0,9 ml par jour n’affectait pas l’hémodynamique des rats et n’entraînait pas de perte de poids significative. Cependant, lorsque le prélèvement sanguin dépasse 1,5 ml, cela peut entraîner une perte de poids17. Dans l’étude de Yokoya et al., des microprélèvements répétés de la veine jugulaire (50 μL à chaque fois, 6 à 7 fois en 24 h) n’ont pas eu d’effet sur le poids corporel du rat ni sur l’apport alimentaire10. De plus, le mode de prélèvement sanguin peut affecter le poids corporel et l’apport alimentaire des rats. Dans une étude antérieure utilisant le prélèvement sanguin par voie intraveineuse sublinguale, un prélèvement de 24 h de 0,5 à 1,0 ml de sang le premier jour a entraîné une réduction du poids corporel du rat et une diminution de l’apport alimentaire, bien que la perte de poids n’ait pas été significative18. Dans cette étude, le poids corporel des rats a continué d’augmenter régulièrement pendant la période de collecte de sang, et il n’y a pas eu de changements significatifs dans la consommation de nourriture et d’eau, les complications liées à la collecte de sang et la mort des rats, ce qui indique que cette méthode est sûre et fiable.
Il est essentiel de souligner que l’acclimatation des rats au processus de contention avant d’effectuer le prélèvement sanguin réduira probablement le stress chez le rat et améliorera le taux de réussite du prélèvement sanguin. Une fixation inadéquate et une exposition insuffisante des veines peuvent entraîner des échecs de collecte de sang et même provoquer une rupture veineuse locale en raison de la lutte des rats dans la douleur. Dans les cas plus bénins, cela pourrait entraîner des hématomes sous-cutanés notables, tandis que dans les cas graves, cela pourrait entraîner la mort des rats. De plus, une mauvaise fixation peut conduire les rats à s’échapper et à causer des dommages aux individus. Par conséquent, nous vous recommandons fortement de bien maîtriser la technique de manipulation avant de procéder à la procédure de prélèvement sanguin. De plus, il est important d’être prudent avec la force appliquée pour faire pivoter l’articulation de l’épaule vers l’extérieur, car une pression excessive pourrait entraîner des fractures de la clavicule chez le rat.
L’une des limites de cette étude est que nous n’avons pas évalué systématiquement les changements de stress induits par cette méthode de prélèvement sanguin chez le rat en mesurant les changements du taux de corticostérone ou en surveillant la cage, ce qui doit être exploré dans de futures recherches. Une autre limite de cet article est l’absence d’autres méthodes de prélèvement sanguin comme moyen de contrôle. Des comparaisons avec d’autres méthodes de prélèvement sanguin pour leurs avantages et leurs inconvénients seront abordées dans les recherches futures. Dans l’ensemble, cette étude introduit une méthode de prélèvement sanguin sur une seule personne sur des rats sans avoir besoin d’anesthésie. Cette approche offre un moyen simple, rapide et sûr d’obtenir des échantillons de sang de rats.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier ou non financier pertinent à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le projet Cuiying Plan du deuxième hôpital de l’Université de Lanzhou (Grant No. PR0121015) et le Laboratoire provincial clé de recherche sur les maladies de l’appareil urinaire du Gansu (subvention n° 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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Ce mois-ci dans JoVE Numéro 201 Rat veine sous-clavière prélèvement sanguinErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
