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Summary
여기에서는 마취 없이 쥐에서 빠르고 안전하며 반복적인 채혈을 가능하게 하는 효과적인 쥐 제한과 쇄골하 정맥 천자 방법의 조합을 제시합니다.
Abstract
쥐로부터 반복적인 혈액 샘플을 얻기 위한 몇 가지 확립된 방법이 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 마취 없는 측면 꼬리 정맥 샘플링과 마취를 통한 경정맥 샘플링입니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 도움과 마취 장비가 필요하며 때로는 혈액 채취 또는 혈액 샘플의 품질이 좋지 않은 측면에서 어려움을 겪습니다. 또한 이러한 채혈 방법은 많은 수의 쥐에 대해 반복적인 혈액 샘플링이 필요할 때 상당한 시간과 인적 자원을 소비합니다. 이 연구는 숙련된 단일 개인이 마취되지 않은 쥐에서 반복적인 혈액 샘플링 기술을 제시합니다. 매우 만족스러운 혈액 샘플은 쇄골하 정맥에 구멍을 뚫어 얻을 수 있습니다. 이 방법은 쥐 억제에서 채혈 완료까지 평균 2분에 불과한 95%의 인상적인 전체 성공률을 보여주었습니다. 또한 지정된 범위 내에서 연속적인 채혈을 수행해도 쥐에게 해를 끼치 지 않습니다. 이 방법은 특히 대규모 약동학 연구에서 혈액 수집을 위해 홍보할 가치가 있습니다.
Introduction
쥐는 가장 흔한 실험 동물 중 하나이며 혈액 샘플을 얻는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 최종 단계에서 단일 채혈을 포함하는 실험의 경우, 심장 천자 또는 복부 대동맥 채혈을 통해 충분한 양의 혈액을 얻을 수 있다1. 그러나 일부 연구에서는 일상적인 혈액 또는 생화학적 분석을 위해 쥐의 반복적인 혈액 채취가 필요하며,특히 약물의 흡수, 분포 및 대사를 결정하기 위해 반복적인 혈액 채취가 필요한 약동학 및 독성학 연구에서 2.
현재 꼬리 정맥 채혈이 쥐의 혈액 채취에 가장 일반적인 방법이지만 마취가 필요하지 않음에도 불구하고 이 방법은 반복적인 채혈이 어려울 수 있으며 채혈된 혈액의 양은 상대적으로 적습니다 3,4. 또한 복재정맥과 음경정맥에서 혈액을 채취할 수 있지만 채취하는 혈액의 양이 제한되어 있어 마취가 필요하다 1,5. 또한, 턱밑 정맥총과 설하정맥, 경정맥 및 쇄골하 정맥에서 채취한 혈액 샘플은 더 높은 품질의 샘플을 제공하지만, 일반적으로 마취 또는 여러 사람의 도움이 필요하다 1,6,7,8,9. 마지막으로, 후안와동/관내 채혈은 마취를 필요로 할 뿐만 아니라 잠재적으로 쥐에게 부상과 스트레스를 유발할 수 있다9.
일반적으로 주요 정맥에서 채취한 혈액 샘플의 품질은 일반적으로 최고 수준이다1. 현재, 일부 연구에서는 경정맥을 통한 연속 미세 샘플링이 쥐의 독성 연구에 매우 적합한 방법임이 밝혀졌지만, 이 방법은 일반적으로 경정맥 카테터 삽입을 필요로 한다 10,11,12. 따라서 외과적 개입 없이 동물 연구의 3R 원칙에 따라 고품질 혈액 샘플을 얻는 방법을 탐구할 가치가 있습니다. 이 연구의 목적은 쥐의 쇄골하 정맥에서 혈액을 효율적으로 추출하는 방법을 제시하는 것이었습니다. 이 기술을 사용하면 마취 없이 한 사람 절차를 통해 만족스러운 샘플을 신속하게 수집할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals13의 8판에 요약된 지침을 준수했습니다. 이 연구는 란저우 대학 제2병원 윤리위원회의 승인을 받았으며 ARRIVE 지침 2.014를 준수하여 문서화되었습니다. 생후 12-16주 된 건강한 위스타 쥐 12마리(수컷 290-330g, 암컷 6마리)를 실제 실험 전 3일 동안 란저우 대학의 GLP 동물 실험실에 수용했습니다. 사용된 쥐 케이지는 545mm x 395mm x 200mm 크기의 R5 유형이었고 오토클레이브 침구 재료가 장착되었습니다. 모든 쥐는 음식과 물을 제한 없이 이용할 수 있었다. 실험실은 평균 습도 25%, 평균 온도 24°C, 낮과 밤이 번갈아 가며 빛의 주기(오전 7:00/오후 7:00)를 유지했습니다. 연구가 끝날 무렵, 모든 동물은 이소플루란을 과다 투여하여 인도적으로 안락사시켰다. 이 연구에 사용된 재료 및 도구에 대한 포괄적인 정보는 재료 표를 참조하십시오.
1. 표본 크기 계산 및 동물 선택
- 방정식 (1)을 사용하여 동물 표본 크기를 추정하려면 자원 방정식 방법15를 선택합니다.
E = 총 동물 수 − 총 그룹 수 (1)
여기서 E 는 분산 분석의 자유도(ANOVA)이며 범위는 10에서 20 사이입니다.
참고: 이 연구에서는 12마리의 동물을 A 와 B 의 두 그룹(그룹당 수컷 3마리, 암컷 3마리)으로 나눴습니다. - 이 연구의 주요 결과를 한 개인이 반복한 혈액 샘플링의 성공률과 시간 소비로 정의합니다.
- 2차 결과 측정을 쥐의 체중, 음식 및 물 섭취량의 변화와 부작용(예: 쇄골 골절, 피하 혈종, 기흉 및 사망률)의 발생률로 정의합니다.
- 성공적인 혈액 채취를 다음 기준을 충족하는 것으로 정의하십시오: i) 단일 혈액 채취에 대해 3회 미만의 천자; ii) 총 시간(쥐 억제에서 채혈 완료까지)이 5분을 초과하지 않아야 합니다. iii) 맑은 혈장을 얻으면서 목표 혈액량을 달성합니다. 이러한 기준에서 벗어나면 샘플링 실패로 간주합니다.
2. 동물 구속 및 채혈
참고: A 군과 B 군 쥐의 혈액 샘플은 두 명의 숙련된 연구원에 의해 수집되었으며, 둘 다 최소 100개의 혈액 샘플을 채취했습니다. 혈액 샘플은 4일 동안 총 96회 두 그룹의 쥐로부터 수집되었습니다. 이 채혈 방법은 쥐에 대한 마취나 추가 구속 장치가 필요하지 않습니다. 그러나 능숙한 처리 기술이 필요합니다.
- 혈액 샘플링 전날(8일차) 오전 00:1에 각 쥐를 개별 케이지에 할당하고 음식과 물의 무게를 잰다. 그런 다음 측정에 눈이 먼 다른 연구원에게 쥐의 체중, 음식 섭취량 및 물 섭취량을 8일차부터 매일 오전 00시에 기록하도록 합니다.
- 이 프로토콜을 따르려면 먼저 오전 10:00에 혈액을 채취한 다음 매일 오후 10:00에 양쪽 쇄골하 정맥에서 교대로 0.15mL의 혈액을 수집합니다.
참고: 수집할 혈액의 양은 가장 체중이 가장 적은 쥐가 일주일 이내에 견딜 수 있는 최대 양에 따라 결정되었습니다. - 주사기에 나트륨 헤파린(25U/mL)을 넣고 주사 부위를 알코올로 소독합니다.
- 쥐의 뒷 피부를 부드럽게 쓰다듬고 목을 반복해서 꼬집어 쥐가 긴장을 풀 수 있도록 도와줍니다(비디오 1).
- 자주 사용하지 않는 손의 엄지와 검지를 사용하여 쥐의 목 피부를 단단히 잡고 들어 올립니다(그림 1A 및 비디오 1).
- 주로 사용하는 손의 협응으로 사용하지 않는 손의 나머지 세 손가락과 손바닥을 사용하여 쥐의 뒷 피부를 고정하고 앞다리를 고정합니다(그림 1B, C 및 비디오 2).
알림: 쥐가 저항하거나 몸부림치면 이 절차를 여러 번 반복하여 쥐가 취급에 익숙해지도록 도울 수 있습니다. 다음 단계는 성공적인 혈액 채취의 핵심입니다. - 주로 사용하지 않는 손의 검지 손가락을 사용하여 쥐의 머리 피부를 부드럽게 누르고 다른 손가락은 손바닥과 함께 어깨 관절을 바깥쪽으로 회전시키는 데 도움을 줍니다. 이 과정에서 주로 사용하는 손을 사용하여 쥐의 어깨 관절을 완전히 펼칩니다(그림 1D-F 및 비디오 2).
- 주로 사용하지 않는 손으로 쥐를 단단히 잡고 쥐의 머리와 몸을 일직선으로 정렬합니다(그림 1G,H). 그런 다음 주로 사용하는 손을 사용하여 쇄골의 위치를 찾고 천자 부위를 확인합니다(그림 1I, 비디오 2 및 비디오 3).
알림: 쥐를 면도할 필요는 없습니다. 그림 1에서 면도는 쇄골과 펑크 위치를 더 많이 보여주기 위해서만 수행되었습니다. 쥐, 특히 쥐>350g)를 제지할 때 쥐가 단단한 표면에 발을 올려놓으면 체중을 지탱하는 데 도움이 됩니다. 또한 구속 장치는 혈액을 채취하는 동안 각 쥐의 호흡수를 모니터링하여 구속이 너무 꽉 조여져 호흡 곤란을 유발할 수 있는지 확인해야 합니다. - 주사기를 쥐의 몸과 평행하게 잡고 바늘 끝이 위쪽을 향하고 주사기 눈금이 실험자를 향하도록 하여 쥐 몸의 정중선과 약 15° 각도를 유지합니다. 쇄골 노치 아래 0.5cm(쇄골과 흉골의 근위 3분의 1이 만나는 지점)에 바늘을 삽입하여 바늘이 쥐의 몸과 평행을 유지하도록 합니다(그림 1J 및 비디오 3).
알림: 혈관을 뚫거나 인접 혈관에 부주의한 손상을 입히지 않도록 바늘 삽입의 각도와 깊이에 특별한 주의를 기울여야 합니다. - 주사기를 약간 당겨 음압을 생성하며, 종종 혈관에 들어갈 때 뚜렷한 돌파감을 동반합니다(특히 초기 채혈 중에 뚜렷함). 이 자세를 유지하고 필요에 따라 일정한 속도로 0.1-1.0mL의 혈액을 수집합니다(주당 약 4-5.3mL/kg의 혈액에 대한 IACUC 지침1에 따름)(그림 1K 및 비디오 3).
- 찔렀을 때 피가 나오지 않으면 바늘의 각도와 깊이를 부드럽게 조정하거나 주사기를 부드럽게 돌려 보십시오(비디오 3). 같은 쪽에서 세 번 연속으로 시도해도 실패하면 모든 출혈을 멈춘 다음 반대쪽으로 전환하여 구멍을 뚫습니다.
알림: 쥐가 불편함으로 인해 고군분투하는 것을 방지하기 위해 피부를 통해 빠르게 구멍을 뚫는 것이 좋습니다. - 지혈을 위해 면봉을 바르고 쥐를 우리로 되돌립니다(비디오 4).
- 실험 요구 사항에 따라 혈액 샘플을 처리합니다.
3. 혈액 샘플 처리
- 주사기 바늘을 날카로운 물건 용기에 버리십시오. 수집된 혈액을 이전에 헤파린으로 헹군 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리기에 넣고 4°C 및 1,200 x g으로 설정하고 10분 동안 원심분리하여 혈장을 분리합니다. 1.0mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈청을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 -80°C에서 보관합니다.
알림: 압력으로 인한 용혈을 방지하려면 필요한 경우 바늘 끝을 제거하십시오. 혈장 흡인 중에는 튜브 바닥에서 혈액 세포를 뽑지 마십시오. 때때로 주사기 표면에 쥐 털이 모일 수 있습니다. 응고를 유발할 수 있으므로 털이 튜브에 들어가지 않도록 주의하십시오.
4. 통계 분석
- 모든 데이터를 평균 ± 표준편차로 표시하고 분산의 균질성을 검정합니다.
- Fisher의 정확 검정을 사용하여 그룹 간의 성공률을 비교합니다.
- 2표본 독립 t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 전체 평균을 비교합니다.
- 혈액 샘플링 시간, 체중, 음식 섭취 및 물 소비량과 같은 연속 측정을 위해 분산 분석(ANOVA)을 사용합니다. P < 0.05를 통계적으로 유의하다고 가정하겠습니다.
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Representative Results
고품질 플라즈마 표본은 그림 2A와 같이 옅은 노란색 색조, 투명도 및 투명도를 나타내며 붉은 색조나 응고가 없습니다. 그림 2B 는 각각 부적절한 시술로 인한 용혈(왼쪽) 또는 응고(오른쪽)를 보여줍니다. 4일 이내에 96회의 채혈 세션 동안 그룹 A 와 B 의 평균 단일 채혈 시간은 각각 119.87초± 33.62초, 123.28초± 30.96초였습니다. 두 그룹 간의 채혈 시간은 매일 유의한 차이가 없었다(t =0.66, P =0.54, 표 1). 가장 짧은 개별 채혈 시간은 각각 78초와 89초였습니다.
성공적인 단일 혈액 채취에 필요한 평균 시도 횟수는 그룹 A와 B에서 각각 1.21회와 1.17회였습니다. 두 그룹 간의 시도 횟수에는 유의한 차이가 없었다(t=0.58, P=0.60, 표 2). 전체 성공률은 그룹 A와 B에서 각각 93.8%(45/48)와 95.8%(46/48)였으며, 두 그룹 간의 전체 성공률에는 유의한 차이가 없었다(P > 0.05, 표 1). 각 시점에서 그룹 B의 채혈 시간에는 유의한 차이가 없었다. A군에서는 둘째 날의 채혈 시간이 넷째 날보다 짧았다(105.75 ± 14.22s vs 144.5 ± 25.45s, t=12.39, P < 0.01; 표 1) 을 클릭합니다. 또한 시도 횟수가 많고 펑크 시간이 길수록 실패율이 높은 경우가 많습니다(그림 3A-C). 셋째 날, 그룹 B는 용혈로 인한 실패를 경험했습니다. 넷째 날, 그룹 A는 세 번의 실패를 경험했는데, 하나는 용혈로 인한 것이고 다른 두 번은 혈액 샘플을 얻을 수 없었기 때문입니다. 그룹 B는 또한 혈액 샘플을 얻을 수 없어 한 번의 실패를 경험했습니다.
4일 연속 관찰 기간 동안 두 그룹의 쥐 모두 꾸준한 체중 증가를 보였습니다. 물과 음식 섭취량은 같은 성별의 쥐들 사이에서 비교적 일정하게 유지되었다. 전체 혈액 채취 과정에서 쥐 폐사 사례는 없었으며, 쇄골 골절, 기흉 또는 천자 부위 혈종과 같은 중요한 합병증도 관찰되지 않았습니다(그림 3D-F 및 표 3).
그림 1: 쥐의 쇄골하 정맥의 고정 및 혈액 수집 방법. (AH) 고정의 조작; (I) 쇄골 및 채혈 부위의 위치; (J-L) 혈액 채취 및 지혈 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈액 샘플을 성공적으로 채취한 경우와 채취하지 못한 경우. (A) 전형적인 혈액 샘플 및 분리된 혈장; (B) 용혈(왼쪽) 및 응고된(오른쪽) 혈액 샘플 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 채혈의 효과와 안전성 평가. (A) 하루 평균 채혈 시간; (B) 하루 평균 펑크 횟수; (C) 두 그룹의 채혈 성공률과 실패율; (DF) 두 그룹의 쥐에서 혈액 수집 중 체중, 음식 섭취 및 물 섭취량의 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 쥐목 혈관의 해부학. (A) 표면 해부학적 구조; (B) 깊은 해부학적 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 | 시간 | 평균 채혈 시간(초) | |||
| 1일차 | 2일차* | 3일차 | 4일차 | ||
| A | 오전 10:00 | 92.83 ± 7.38 | 100.5 ± 17.36 | 117.83 ± 12.02 | 146.6 ± 24.76 |
| 오후 10:00 | 10.86± 108.67 | 111.00 ± 6.95 | 158.33 ± 60.47 | 142.40 ± 25.96 | |
| 평균 시간 | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144.5 ± 25.45 | |
| 성공률 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| 전체 성공률 | 93.8% (45/48) | ||||
| 전체 평균 시간 | 119.87 ± 33.62 | ||||
| B | 오전 10:00 | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123.67 ± 30.99 | 147.2 ± 17.47 |
| 오후 10:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165.67 ± 49.70 | |
| 평균 시간 | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157.27 ± 39.63 | |
| 성공률 | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| 전체 성공률 | 95.8% (46/48) | ||||
| 전체 평균 시간 | 123.28 ± 30.96 | ||||
표 1: 두 그룹의 쥐의 혈액 채취 시간 및 성공률. *2일째의 채혈 시간은 A 군에서 4일째보다 짧았다(t =12.39 P < 0.01).
| 그룹 | 시간 | 평균 펑크 수 | |||
| 1일차 | 2일차 | 3일차 | 4일차 | ||
| A | 오전 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 오후 10:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| 평균의 | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| 전체 평균 | 1.21 | ||||
| B | 오전 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 오후 10:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| 평균의 | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| 전체 평균 | 1.17 | ||||
표 2: 쥐의 채혈을 위한 평균 천자 수.
| 성별 | 그룹 | 무게 (g) | 음식 섭취량 (g) | 수분 섭취량(g) | |||||||||
| 1일차 | 2일차 | 3일차 | 4일차 | 1일차 | 2일차 | 3일차 | 4일차 | 1일차 | 2일차 | 3일차 | 4일차 | ||
| ♀ | A | 260 ± 7.5 | 267.7 ± 6.3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13.3 ± 0.79 | 13.5 ± 0.93 | 14.0 ± 0.29 | 14.0 ± 0.77 | 23.9 ± 0.36 | 23.1 ± 0.77 | 24.4 ± 0.70 | 24.6 ± 0.12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268.3 ± 14.0 | 272.7 ± 9.4 | 7.0± 279 | 14.4 ± 0.45 | 13.9 ± 0.52 | 14.7 ± 0.26 | 14.3 ± 0.56 | 23.6 ± 0.73 | 23.7 ± 0.65 | 24.4 ± 0.91 | 24.1 ± 1.79 | |
| 티/큐 | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| 조정된 P 값 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | A | 313.7 ± 12.0 | 325.7 ± 9.1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15.6 | 15.9 ± 0.64 | 16.2 ± 0.08 | 15.7 ± 0.70 | 15.9 ± 0.73 | 26.2 ± 0.62 | 27.2 ± 0.9 | 26.9 ± 1.0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16.4 | 322.3 ± 18.0 | 330.7 ± 17.6 | 342 ± 16.9 | 15.3 ± 0.74 | 15.7 ± 0.85 | 15.1 ± 0.33 | 15.3 ± 0.86 | 27.1 ± 0.37 | 25.6 ± 1.27 | 27.5 ± 0.76 | 26.2 ± 0.99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| 조정된 P 값 | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
표 3: 쥐의 일일 체중, 음식 섭취량, 수분 섭취량의 변화.
비디오 1 : 쥐의 진정 및 취급. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 2: 쥐 억제 절차. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3: 쥐의 채혈 절차. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 4: 천자 부위의 지혈 압박. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
꼬리 정맥 채혈은 쥐의 반복 혈액 채취를 위한 가장 일반적인 방법이지만, 마취제의 영향을 받을 수 있으며, 꼬리 정맥의 크기가 작기 때문에 한 번에 채취할 수 있는 혈액의 양이 제한되어 채혈 시간이 길어진다 4,5. 쥐 꼬리 정맥의 모세관 마이크로샘플링(CMS)과 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-탠덤 질량분석법(MS/MS) 시스템은 쥐에서 사용되는 혈액의 양을 줄일 수 있지만11, 모든 기관이 이 고가의 장비를 갖추고 있는 것은 아니다. 후구신경총/부비동에서 채취한 혈액 채취는 종종 쥐에게 불안과 통증을 유발하며, 부적절한 수술은 쥐의 시력과 건강을 손상시킬 수도 있습니다. 따라서 이 방법은 쥐의 혈액 채취에는 권장되지 않는다9.
쇄골하 정맥은 쥐의 대흉근과 삼각근 사이에 위치하며 내부 쇄골의 1/3에서 경정맥으로 배출됩니다(그림 4). Yang et al.의 연구에서, 마취 하에 쥐의 쇄골하 정맥에서 혈액 채취의 성공률은 숙련된 작업자에 의해 약 90%였으며, 천자의 시작부터 끝까지의 최소 시간은 65초7였습니다. Wang et al.의 연구에서는 수직 접근 방식을 사용하여 쥐의 쇄골하 정맥에서 혈액 샘플을 수집했습니다. 그들의 방법은 마취를 수반하지 않았지만, 쥐를 안전하게 제한하기 위해서는 두 사람의 협력이 필요했다6. 이 연구 프로토콜은 혈액 수집의 좋은 이점을 보여줍니다. 이 프로토콜에는 특별한 구속 장치나 마취 시설이 필요하지 않습니다. 적절하게 다루면 쥐는 일반적으로 최소한의 저항을 보입니다. 쥐 억제에서 채혈 완료까지의 평균 시간은 단 2분으로 95%라는 인상적인 전체 성공률을 달성했습니다. 이 방법은 인적 자원을 크게 절약하고 채혈에 필요한 시간을 줄입니다. 또한, 얻어진 혈장 샘플은 투명하고 투명하며, 용혈 및 응고 현상의 발생을 최소화하여 실험 반복을 최소화합니다. 이 기술에 대한 숙련도는 반복적인 혈액 수집이 필요한 대규모 쥐 약동학 및 독성학 실험을 관리하는 데 특히 유용합니다.
우리 연구에서 채혈 실패의 주요 발생은 4일째였으며, 이는 반복적인 천자로 인한 정맥 손상과 관련이 있을 수 있습니다. 반복적인 천자는 혈관 벽의 손상으로 이어질 수 있으며 염증 반응을 일으켜 혈관 벽이 두꺼워지고 굳어지며 혈관 협착을 유발할 수도 있습니다. 천자 후 지혈이 불충분하면 유출된 혈액이 조직 부종과 염증을 유발하여 흉터 조직을 형성할 수 있습니다. 이러한 흉터 조직은 침투하기 어렵고 혈관을 잡아당겨 위치를 이동시킬 수 있으며, 이 모든 것이 혈관을 찾고 구멍을 뚫는 것을 더 어렵게 만듭니다. 우리 연구에서는 채혈을 위해 26G 주사기(0.45mm)를 사용했는데, 이는 인간 정맥에 비해 미세하지만 여전히 쥐 정맥에 상당한 손상을 일으킵니다. 이는 첫 번째 채혈 시 바늘이 혈관을 통과할 때 관통감이 뚜렷하게 느껴지는 것으로 입증되며, 채혈 횟수가 증가함에 따라 채혈 시간이 길어지고 실패율이 높아집니다. 따라서 채혈 시 더 가는 인슐린 바늘을 사용하는 것이 좋으며, 채혈 후 혈종 형성을 방지하기 위해 적절한 압력을 가하고 충분한 정맥 복구가 가능하도록 번갈아 채혈을 해야 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 잘 훈련된 정맥 전문의는 26G 바늘을 사용하여 24시간 이내에 동일한 쥐의 양측 쇄골하 정맥에서 8-10번 번갈아 가며 혈액을 채취할 수 있으며, 각 채혈 사이의 평균 간격은 2-3시간입니다. 그러나 쥐가 견딜 수 있는 최대 채혈 횟수, 회복 기간 및 채혈 주기는 사용된 바늘 게이지, 다양한 실험에 필요한 채혈 간격 및 정맥 절제술사의 숙련도에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 요인은 향후 연구에서 더 자세히 조사되어야 합니다. 약동학 실험에 필요한 집중 혈액 채취의 경우 좌우 쇄골하 정맥에서 번갈아 혈액을 채취하는 것이 좋습니다. 실제로 혈액을 채취할 수 없는 경우에는 다른 채혈 방법을 보완할 수 있습니다.
체중, 수분 섭취량 및 음식 섭취량은 쥐의 건강 상태를 평가하는 가장 기본적이고 간단한 지표이다16. 초기 연구에 따르면 하루에 0.9mL 미만의 경정맥을 통한 혈액 수집은 쥐의 혈류역학에 영향을 미치지 않으며 상당한 체중 감소를 초래하지 않았습니다. 그러나 채혈량이 1.5mL를 초과하면 체중 감소로 이어질 수 있다17. Yokoya et al.의 연구에서, 경정맥에서 반복적인 미세 샘플링(매번 50μL, 24시간 이내에 6-7배)은 쥐의 체중이나 음식 섭취에 영향을 미치지 않았다10. 또한 혈액 수집 방식은 쥐의 체중과 음식 섭취량에 영향을 미칠 수 있습니다. 설하정맥 채혈을 이용한 이전 연구에서, 첫날 0.5-1.0mL의 혈액을 24시간 동안 채혈한 결과, 체중 감소는 유의하지 않았지만 쥐의 체중이 감소하고 음식 섭취량이 감소했다18. 본 연구에서 쥐의 체중은 채혈 기간 동안 여전히 꾸준히 증가했으며, 먹이와 물 섭취량, 채혈 관련 합병증 및 쥐의 폐사에 큰 변화가 없어 이 방법이 안전하고 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.
채혈을 수행하기 전에 쥐를 구속 과정에 적응시키면 쥐의 스트레스가 줄어들고 채혈 성공률이 향상될 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 부적절한 고정과 불충분한 정맥 노출은 혈액 수집 실패로 이어질 수 있으며 쥐가 고통에 몸부림치기 때문에 국소 정맥 파열을 유발할 수도 있습니다. 경미한 경우에는 눈에 띄는 피하 혈종을 유발할 수 있으며 심한 경우에는 쥐 사망으로 이어질 수 있습니다. 또한 고정이 잘못되면 쥐가 탈출하여 개인에게 해를 끼칠 수 있습니다. 따라서 채혈 절차를 진행하기 전에 취급 기술을 철저히 숙지하는 것이 좋습니다. 또한 어깨 관절을 바깥쪽으로 회전시킬 때 가해지는 힘에 주의하는 것이 중요한데, 과도한 압력은 쥐의 쇄골 골절로 이어질 수 있기 때문입니다.
본 연구의 한계는 쥐의 이러한 채혈 방법에 의해 유발된 스트레스의 변화를 코르티코스테론 수치의 변화를 측정하거나 케이지 측 모니터링을 통해 체계적으로 평가하지 않았다는 점이며, 이는 향후 연구에서 살펴볼 필요가 있다. 이 기사의 또 다른 한계는 대조군으로서의 대체 혈액 수집 방법이 없다는 것입니다. 다른 채혈 방법과의 장단점 비교는 향후 연구에서 다루어질 것입니다. 전체적으로 이 연구는 마취 없이 쥐로부터 한 사람의 혈액을 채취하는 방법을 소개합니다. 이 접근 방식은 쥐로부터 혈액 샘플을 얻는 간단하고 빠르며 안전한 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 관련 재정적 또는 비재정적 이해관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 란저우 대학 제2병원의 Cuiying Plan Project(Grant No. PR0121015) 및 간쑤성 비뇨기계 질환 연구 핵심 연구소(보조금 번호 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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이번 달 JoVE 201호 쥐 쇄골하 정맥 혈액 샘플링Erratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
