ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Här presenterar vi en kombination av effektiv råttrestriktion och subclavian venpunktionsmetoder som möjliggör snabb, säker och upprepad blodinsamling hos råttor utan bedövning.
Abstract
Det finns flera etablerade metoder för att ta upprepade blodprover från råttor, där de vanligaste metoderna är lateral svansvensprovtagning utan bedövning och jugulära venprovtagning med anestesi. De flesta av dessa metoder kräver dock assistans och anestesiutrustning och innebär ibland svårigheter när det gäller blodinsamling eller dålig kvalitet på blodprover. Dessutom tar dessa metoder för blodinsamling betydande tid och mänskliga resurser när upprepad blodprovstagning krävs för ett stort antal råttor. Denna studie presenterar en teknik för upprepad blodprovstagning på icke-sövda råttor av en enda skicklig individ. Mycket tillfredsställande blodprover kan erhållas genom att punktera venen subclavia. Metoden visade en imponerande total framgångsfrekvens på 95 %, med en mediantid på bara 2 minuter från råttans fasthållning till avslutad blodinsamling. Att utföra på varandra följande blodinsamlingar inom det angivna intervallet orsakar inte heller någon skada på råttorna. Denna metod är värd att främja för blodinsamling, särskilt i storskaliga farmakokinetiska studier.
Introduction
Råttor är ett av de vanligaste försöksdjuren och det finns många sätt att ta blodprover. För försök med en enda blodprovstagning i slutskedet kan en tillräcklig mängd blod erhållas genom hjärtpunktion eller blodinsamling av bukaorta1. Vissa studier kräver dock upprepad blodinsamling från råttor för rutinmässig blodanalys eller biokemisk analys, särskilt i farmakokinetiska och toxikologiska studier, där upprepad blodinsamling krävs för att bestämma absorption, distribution och metabolism av läkemedel2.
För närvarande, även om blodinsamling från svansvener är den vanligaste metoden för blodprovstagning från råttor, trots att den inte kräver anestesi, kan denna metod vara utmanande för upprepade insamlingar, och volymen blod som samlas in är relativt liten 3,4. Dessutom, även om blod kan samlas in från venerna saphenus och penis, är mängden blod som erhålls begränsad och anestesi krävs 1,5. Dessutom ger blodprover som samlas in från den submandibulära venösa plexus, såväl som sublinguala, jugulära och subclavian vener av högre kvalitet men kräver vanligtvis anestesi eller hjälp av flera individer 1,6,7,8,9. Slutligen kräver blodinsamling i retroorbital sinus/kanal inte bara anestesi utan kan också potentiellt orsaka skada och stress för råttorna9.
Kvaliteten på blodprover som vanligtvis tas från större vener är i allmänhet av högsta standard1. För närvarande har vissa studier visat att kontinuerlig mikroprovtagning genom halsvenen är en mycket lämplig metod för toxikologisk forskning på råttor, även om denna metod vanligtvis kräver jugular venkateterisering 10,11,12. Därför är det värt att undersöka hur man kan få blodprover av hög kvalitet i enlighet med 3R-principen för djurförsök utan kirurgiska ingrepp. Syftet med denna studie var att presentera en metod för att effektivt extrahera blod från nyckelbensvenen hos råttor. Denna teknik möjliggör snabb insamling av tillfredsställande prover genom ett förfarande med en person utan behov av anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie följde de riktlinjer som beskrivs i den 8:e upplagan av Guide for the Care and Use of Laboratory Animals13. Forskningen godkändes av den etiska kommittén vid Lanzhou University Second Hospital och dokumenterades i enlighet med riktlinjerna för ARRIVE 2.014. Tolv friska Wistar-råttor (sex hanar som vägde 290-330 g och sex honor som vägde 250-280 g) i åldrarna 12-16 veckor inkvarterades i GLP Animal Laboratory vid Lanzhou University i 3 dagar före själva experimentet. Råttburarna som användes var av R5-typ, med måtten 545 mm x 395 mm x 200 mm, och var utrustade med autoklaverat strömaterial. Alla råttor fick obegränsad tillgång till både mat och vatten. Laboratoriet upprätthöll en genomsnittlig luftfuktighet på 25 %, en medeltemperatur på 24 °C och en ljuscykel som växlade mellan dag och natt (07:00/19:00). I slutet av studien avlivades alla djur på ett humant sätt med hjälp av en överdos av isofluran. För omfattande information om de material och instrument som används i denna studie, se materialtabellen.
1. Beräkning av stickprovsstorlek och urval av djur
- Välj resursekvationsmetod15 för att uppskatta djurprovets storlek med hjälp av ekvation (1).
E = Totalt antal djur − Totalt antal grupper (1)
Där E är graden av variansanalys (ANOVA) och sträcker sig från 10 till 20.
OBS: I denna studie delades 12 djur in i två grupper A och B (tre hanar och tre honor per grupp). - Definiera det primära resultatet av denna studie som framgångsfrekvensen och tidsåtgången för upprepad blodprovstagning av en enskild individ.
- Definiera de sekundära utfallsmåtten som förändringar i råttans kroppsvikt, födo- och vattenintag samt incidensen av biverkningar (såsom nyckelbensfrakturer, subkutant hematom, pneumothorax och mortalitet).
- Definiera framgångsrik blodprovstagning som att uppfylla följande kriterier: i) färre än tre punkteringar för en enda blodprovstagning; ii) En total tid (från fasthållning av råtta till avslutad blodinsamling) som inte överstiger 5 minuter. och iii) uppnå den önskade blodvolymen samtidigt som man erhåller klar plasma. Betrakta alla avvikelser från dessa kriterier som ett samplingsfel.
2. Fasthållning av djur och blodinsamling
OBS: Blodprover från grupp A - och B-råttor samlades in av två erfarna forskare, som båda hade tagit minst 100 blodprover. Blodprover samlades in från båda grupperna av råttor totalt 96 gånger under 4 dagar. Denna blodinsamlingsmetod kräver ingen bedövning eller ytterligare fasthållningsanordningar för råttorna. Det kräver dock skickliga hanteringstekniker.
- Klockan 08.00 dagen före blodprovstagningen (dag 1) ska varje råtta placeras i en egen bur medan mat och vatten vägs. Låt sedan en annan forskare, som är blind för mätningarna, registrera råttornas vikt, matkonsumtion och vattenintag varje dag klockan 8:00 från dag 1 och framåt.
- För att följa detta protokoll, ta först blodprov kl. 10.00 och sedan kl. 22.00 varje dag, och samla in 0,15 ml blod växelvis från nyckelbensvenerna på båda sidor.
OBS: Mängden blod som skulle samlas in bestämdes av den maximala volymen som den lägst viktande råttan kunde tolerera inom en vecka. - Spola en spruta med natriumheparin (25 E/ml) och desinficera injektionsstället med alkohol.
- Stryk försiktigt över råttans rygghud och nyp den i nacken upprepade gånger för att hjälpa råttan att slappna av (video 1).
- Använd den icke-dominanta handens tumme och pekfinger för att ta tag i och lyfta råttans nackhud ordentligt (Figur 1A och Video 1).
- Med koordination från den dominanta handen, använd de återstående tre fingrarna och handflatan på den icke-dominanta handen för att säkra råttans rygghud och immobilisera dess främre extremiteter (Figur 1B, C och Video 2).
OBS: Om råttan gör motstånd eller kämpar kan denna procedur upprepas flera gånger för att hjälpa råttan att vänja sig vid hanteringen. Följande steg är nyckeln till framgångsrik blodinsamling. - Använd den icke-dominanta handens pekfinger och tryck försiktigt ner på råttans huvudhud medan de andra fingrarna, tillsammans med handflatan, hjälper till att rotera axelleden utåt. Under denna process, använd den dominanta handen för att helt sträcka ut råttans axelled (Figur 1D-F och Video 2).
- Ta ett stadigt tag i råttan med den icke-dominanta handen för att rikta in råttans huvud och kropp i en rak linje (Figur 1G,H). Använd sedan den dominanta handen för att lokalisera nyckelbenets position och bekräfta punkteringsstället (Figur 1I, Video 2 och Video 3).
OBS: Det är inte nödvändigt att raka råttan. I figur 1 gjordes rakning endast för att visa nyckelbenet och punkteringspositionen i större utsträckning. När du håller fast råttor, särskilt råttor >350 g, kan du låta råttan vila fötterna på en fast yta för att stödja deras kroppsvikt. Dessutom bör fasthållningsanordningen övervaka andningsfrekvensen hos varje råtta samtidigt som den samlar upp blod för att säkerställa att fasthållningen inte är för hård, vilket kan orsaka andnöd. - Håll sprutan parallell med råttans kropp i den dominanta handen, med nålspetsen vänd uppåt och sprutskalan mot försöksledaren, och håll en vinkel på cirka 15° mot mittlinjen på råttans kropp. Stick in nålen 0,5 cm under nyckelbensskåran (vid korsningen mellan den proximala tredjedelen av nyckelbenet och bröstbenet) och se till att nålen förblir parallell med råttans kropp (Figur 1J och Video 3).
OBS: Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt vinkeln och djupet på nålinsättningen för att undvika att blodkärlet genomborras eller orsakar oavsiktlig skada på intilliggande kärl. - Dra försiktigt ut sprutan något för att skapa ett undertryck, ofta åtföljt av en påtaglig känsla av genombrott när den kommer in i blodkärlet (särskilt uttalad under den första bloduppsamlingen). Behåll denna position och samla upp 0,1-1,0 ml blod med konstant hastighet efter behov (enligt IACUC:s riktlinjer på cirka 4-5,3 ml/kg blod per vecka1) (Figur 1K och Video 3).
- Om det inte finns något blod vid punktering, försök att försiktigt justera nålens vinkel och djup eller vrid försiktigt sprutan (video 3). Om tre på varandra följande försök på samma sida misslyckas, stoppa all blödning och byt sedan till motsatt sida för punkteringen.
OBS: Snabb punktering genom huden är tillrådligt för att förhindra att råttan kämpar på grund av obehag. - Applicera en bomullspinne för hemostas och sätt tillbaka råttan i sin bur (video 4).
- Behandla blodproverna enligt de experimentella kraven.
3. Bearbetning av blodprov
- Kassera sprutkanylen i en behållare för vassa föremål. Överför det uppsamlade blodet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som tidigare sköljts med heparin. Placera röret i en centrifug, ställ in det på 4 °C och 1 200 x g och centrifugera i 10 minuter för att separera plasma. Överför serumet med en 1,0 ml Pasteur-pipett till ett rent mikrocentrifugrör och förvara det vid -80 °C.
OBS: För att förhindra hemolys på grund av tryck, ta bort nålspetsen vid behov. Under plasmaaspiration ska du undvika att ta blodkroppar från botten av röret. Ibland kan sprutans yta samla råttpäls; Var noga med att inte låta någon päls komma in i röret, eftersom det kan leda till koagulering.
4. Statistisk analys
- Presentera alla data som medelvärde ± standardavvikelse och testa dem för varianshomogenitet.
- Använd Fishers exakta test för att jämföra framgångsfrekvensen mellan grupper.
- Använd ett oberoende t-test med två urval för att jämföra det totala medelvärdet mellan de två grupperna.
- Använd variansanalys (ANOVA) för kontinuerliga mätningar som blodprovstagningstid, kroppsvikt, matintag och vattenkonsumtion. Betrakta P < 0,05 som statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasmaprover av hög kvalitet uppvisar en blekgul nyans, klarhet och transparens, utan någon röd nyans eller koagulering, som avbildas i figur 2A. Figur 2B visar hemolys (vänster sida) respektive koagulation (höger sida) som ett resultat av felaktiga procedurer. Under loppet av 96 blodprovstagningar inom 4 dagar var de genomsnittliga enskilda blodinsamlingstiderna för grupperna A och B 119,87 ± 33,62 s respektive 123,28 ± 30,96 s. Det fanns ingen signifikant skillnad i blodinsamlingstiderna mellan de två grupperna på daglig basis (t = 0,66, P = 0,54, tabell 1). De kortaste individuella blodinsamlingstiderna var 78 s respektive 89 s.
Det genomsnittliga antalet försök som krävdes för en lyckad enskild blodinsamling var 1,21 och 1,17 för grupp A respektive B. Det fanns ingen signifikant skillnad i antalet försök mellan de två grupperna (t = 0,58, P = 0,60, tabell 2). Den totala framgångsfrekvensen var 93,8 % (45/48) och 95,8 % (46/48) för grupp A respektive B, utan någon signifikant skillnad i den totala framgångsfrekvensen mellan de två grupperna (P > 0,05, tabell 1). Det fanns ingen signifikant skillnad i tidpunkten för blodinsamling i grupp B vid varje tidpunkt. I grupp A var blodinsamlingstiden den andra dagen kortare än den fjärde dagen (105,75 ± 14,22 s mot 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabell 1) . – Herr talman, Dessutom indikerar fler försök och längre punkteringstider ofta högre felfrekvens (Figur 3A-C). På den tredje dagen stötte grupp B på ett fel som berodde på hemolys. På den fjärde dagen stötte grupp A på tre misslyckanden: ett på grund av hemolys och de andra två på grund av oförmågan att ta blodprover. Grupp B upplevde också ett misslyckande på grund av oförmågan att få ett blodprov.
Under 4 på varandra följande observationsdagar uppvisade båda grupperna av råttor en stadig viktökning. Vatten- och födointag förblev relativt konstant bland råttor av samma kön. Under hela blodinsamlingsprocessen förekom inga fall av dödlighet hos råtta, och inga signifikanta komplikationer observerades heller, såsom nyckelbensfrakturer, pneumothorax eller hematom vid punktionsstället (Figur 3D-F och Tabell 3).
Figur 1: Fixerings- och blodinsamlingsmetoder för nyckelbensvenen hos råttor. (A-H) Manipulering av fixering; I) Nyckelbenets och blodprovsställets läge. (J-L) processen för blodinsamling och hemostas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Lyckat och misslyckat insamlat blodprover. A) Typiska blodprover och isolerad plasma. (B) hemolyserade (vänster) och koagulerade (höger) blodprover Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utvärdering av blodinsamlingens effektivitet och säkerhet. A) Genomsnittlig tid för blodinsamling per dag. B) Genomsnittligt antal punkteringar per dag. C) Framgångs- och misslyckandefrekvens vid blodinsamling i båda grupperna. (D-F) förändringar i kroppsvikt, födointag och vattenintag under blodinsamling hos båda grupperna av råttor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Anatomi hos råtthalskärl. A) Ytliga anatomiska strukturer. (B) djupa anatomiska strukturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Grupp | Tid | Genomsnittlig tid för insamling av blod | |||
| Dag 1 | Dag 2* | Dag 3 | Dag 4 | ||
| A | 10:00 AM | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108,67 ± 10,86 | 111,00 ± 6,95 | 158,33 ± 60,47 | kl 142,40 ± 25,96 | |
| Genomsnittlig tid | 100,75 ± 12,20 | Kl. 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Framgång frekvens | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Total framgångsfrekvens | 93.8% (45/48) | ||||
| Total genomsnittlig tid | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 AM | 98,17 ± 7,24 | kl. 110.17 ± kl. 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | Kl. 106.00 ± 14.35 | kl. 126,67 ± 17,12 | Kl. 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Genomsnittlig tid | 102,08 ± 12,02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Framgång frekvens | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Total framgångsfrekvens | 95.8% (46/48) | ||||
| Total genomsnittlig tid | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabell 1: Blodinsamlingstider och framgångsfrekvens för de två grupperna av råttor. *Blodinsamlingstiden för den andra dagen var kortare än den för den fjärde dagen i grupp A (t = 12,39 P < 0,01).
| Grupp | Tid | Genomsnittligt antal punkteringar | |||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| A | 10:00 AM | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Genomsnitt | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Totalt genomsnitt | 1.21 | ||||
| B | 10:00 AM | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Genomsnitt | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Totalt genomsnitt | 1.17 | ||||
Tabell 2: Genomsnittligt antal punkteringar för bloduppsamling hos råttor.
| Genus | Grupp | Vikt (g) | Födointag (g) | Vattenintag (g) | |||||||||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| ♀ | A | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5,4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| t/q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Justerat P-värde | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | >0.99 | |
| ♂ | A | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25,3 ± 1,1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Justerat P-värde | 0.94 | 0.86 | >0.99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabell 3: Förändringar i daglig kroppsvikt, födointag och vattenintag hos råttor.
Video 1: Lugnande och hantering av råttor. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Fasthållningsprocedurer för råttor. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Blodinsamlingsproceduren för råttor. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Hemostatisk kompression vid punkteringsstället. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om blodinsamling i svansvenen är den vanligaste metoden för upprepad blodprovstagning hos råttor, kan den påverkas av anestesiläkemedel, och på grund av svansvenens lilla storlek är mängden blod som kan samlas in vid ett enda tillfälle begränsad, vilket leder till en längre tid för blodinsamling 4,5. Även om högpresterande vätskekromatografi (HPLC) -tandemmasspektrometri (MS/MS) system i kombination med kapillär mikroprovtagning (CMS) av råttsvansvener kan minska mängden blod som används hos råttor11, är inte alla institutioner utrustade med denna dyra utrustning. Blodprovstagning från retrobulbar plexus/sinus orsakar ofta ångest och smärta hos råttor, och felaktig användning kan till och med skada synen och hälsan hos råttor. Därför rekommenderas inte denna metod för blodprovstagning hos råttor9.
Nyckelbensvenen är belägen mellan pectoralis major och deltoideusmuskeln hos råttan och dräneras in i halsvenen vid en tredjedel av det inre nyckelbenet (Figur 4). I studien av Yang et al. var framgångsfrekvensen för blodinsamling från nyckelbensvenen hos råttor under narkos cirka 90 % av en skicklig operatör, vars minsta tid från början till slutet av punktionen var 65 s7. I Wang et al.:s studie samlades blodprover in från råttans subclavian vener med hjälp av en vertikal metod. Även om deras metod inte innebar bedövning, krävde den samarbete mellan två individer för att på ett säkert sätt begränsa råttan6. Detta studieprotokoll visar en god fördel med blodinsamling. Detta protokoll kräver inga särskilda fasthållningsanordningar eller anestesianläggningar. Med korrekt hantering uppvisar råttor i allmänhet minimalt motstånd. Mediantiden från fasthållning av råttor till avslutad blodinsamling var endast 2 minuter, vilket gav en imponerande total framgångsfrekvens på 95 %. Denna metod sparar avsevärt mänskliga resurser och minskar den tid som krävs för blodinsamling. Vidare är de erhållna plasmaproverna klara och transparenta, med minimal förekomst av hemolys och koagulationshändelser, vilket minimerar upprepning av experiment. Kunskaper i denna teknik är särskilt värdefulla för att hantera storskaliga farmakokinetik- och toxikologiska experiment på råttor som kräver upprepad blodinsamling.
I vår studie var den huvudsakliga förekomsten av blodprovsfel dag 4, vilket kan vara relaterat till den venösa skadan som orsakas av upprepade punkteringar. Upprepade punkteringar kan leda till skador på kärlväggen och framkalla en inflammatorisk reaktion, vilket gör att kärlväggen tjocknar och hårdnar, och till och med inducerar kärlförträngning. Om hemostasen är otillräcklig efter punktion kan det extravaserade blodet ytterligare orsaka vävnadsödem och inflammation, vilket därefter leder till att ärrvävnad bildas. Dessa ärrvävnader är svåra att tränga igenom och kan också dra och få blodkärlen att ändra position, vilket gör blodkärlen svårare att lokalisera och punktera. I vår studie användes en 26G-spruta (0,45 mm) för blodinsamling, vilket är bra i förhållande till mänskliga vener men fortfarande orsakar betydande skador på råttvener. Detta bevisas av den tydliga känslan av penetration när nålen passerar genom kärlet under det första blodprovet, som minskar när antalet blodprov ökar, med längre blodinsamlingstider och högre felfrekvens. Därför rekommenderar vi att du använder en finare insulinnål för bloduppsamling, och tillräckligt tryck bör appliceras efter bloduppsamling för att förhindra hematombildning, och alternativa blodprov bör utföras för att möjliggöra tillräcklig venös reparation. Enligt vår erfarenhet kan en välutbildad flebotomist använda en 26G-nål för att växelvis ta blod från de bilaterala subclaviala venerna hos samma råtta 8-10 gånger inom 24 timmar, med ett genomsnittligt intervall på 2-3 timmar mellan varje blodprov. Det maximala antalet blodprov som en råtta kan tolerera, återhämtningsperioden och blodprovscykeln kan dock påverkas av den nålmätare som används, de blodprovsintervall som krävs av olika experiment och flebotomistens skicklighet. Dessa faktorer behöver undersökas ytterligare i framtida forskning. För intensiv blodprovstagning som krävs för farmakokinetiska experiment är det bättre att växelvis samla in blod från vänster och höger subclavian ven. I de fall där det verkligen inte finns att tillgå kan andra metoder för blodinsamling kompletteras.
Kroppsvikt, vattenkonsumtion och matintag är de mest grundläggande och okomplicerade indikatorerna för att bedöma råttors hälsotillstånd16. En tidig studie hade visat att bloduppsamling via halsvenen på mindre än 0,9 ml per dag inte påverkade hemodynamiken hos råttor och inte resulterade i någon signifikant viktminskning. Men när blodinsamlingen överstiger 1,5 ml kan det leda till viktminskning17. I studien av Yokoya et al. påverkade upprepad mikroprovtagning från halsvenen (50 μL varje gång, 6-7 gånger inom 24 timmar) inte råttans kroppsvikt eller födointag10. Dessutom kan sättet att samla in blod påverka råttornas kroppsvikt och födointag. I en tidigare studie med sublingual venblodinsamling resulterade en 24-timmarsinsamling av 0,5-1,0 ml blod den första dagen i en minskning av råttans kroppsvikt och minskat födointag, även om viktminskningen inte var signifikant18. I denna studie ökade råttornas kroppsvikt fortfarande stadigt under blodinsamlingsperioden, och det fanns inga signifikanta förändringar i mat- och vattenintag, blodinsamlingsrelaterade komplikationer och råttornas död, vilket tyder på att denna metod är säker och pålitlig.
Det är viktigt att betona att acklimatisering av råttorna till fasthållningsprocessen innan blodinsamling utförs sannolikt kommer att minska stressen hos råttan och förbättra framgångsgraden för blodinsamlingen. Otillräcklig fixering och otillräcklig venexponering kan leda till att blodinsamlingen misslyckas och till och med orsaka lokal venruptur på grund av att råttorna kämpar i smärta. I mildare fall kan detta resultera i märkbara subkutana hematom, medan det i allvarliga fall kan leda till dödsfall bland råttor. Dessutom kan dålig fixering leda till att råttor rymmer och skadar individer. Därför rekommenderar vi starkt att du behärskar hanteringstekniken noggrant innan du fortsätter med blodinsamlingsproceduren. Dessutom är det viktigt att vara försiktig med den kraft som appliceras för att rotera axelleden utåt, eftersom överdrivet tryck kan leda till nyckelbensfrakturer hos råttan.
En begränsning med denna studie är att vi inte systematiskt utvärderade de förändringar i stress som inducerades av denna blodinsamlingsmetod hos råttor genom att mäta förändringarna i kortikosteronnivån eller genom övervakning vid buren, vilket behöver undersökas i framtida forskning. En annan begränsning i denna artikel är frånvaron av alternativa blodinsamlingsmetoder som kontroll. Jämförelser med andra blodinsamlingsmetoder för deras för- och nackdelar kommer att behandlas i framtida forskning. Sammantaget introducerar denna studie en metod för insamling av blod från råttor utan behov av anestesi. Detta tillvägagångssätt erbjuder ett enkelt, snabbt och säkert sätt att få blodprover från råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta ekonomiska eller icke-finansiella intressen att redovisa.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Cuiying Plan Project vid Lanzhou University Second Hospital (Grant No. PR0121015) och Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (anslag nr 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
Denna månad i JoVE Råtta subclavian ven blodprovstagningErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
