Den CApillary FEeder (CAFE) Assay: En metode til at spore fødevareforbrug og præference i Drosophila

Overview

Denne video beskriver CApillary FEeder, eller CAFE, assay, en adfærdsmæssig metode, der måler fødeindtagelse og præference for uhæmmet frugt fluer. Den fremhævede protokol viser, hvordan man udfører analysen med minimal fordampning fra de væskefyldte kapillærer, der bruges til at levere maden og spore dens indtag.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Samling og udførelse af CApillary FEeder Assay

1. Hvis faste ikke er nødvendig, skal du overføre de eksperimentelle fluer til analysen ved at trykke eller ved slagrør. Sørg for at inkludere tre kontrolglas uden fluer for at kvantificere fordampning.
2. Fjern forsigtigt en pipettespids (2 - 20 μL volumen), der lukker en af de ydre åbninger, og indsæt en fyldt glaskapillær, nederste ende først. Fastgør kapillæren ved at placere pipettespidsen tilbage ved siden af kapillæren. Hvis flere fødevareopløsninger testes, skal du gentage denne procedure i overensstemmelse hermed.
3. Placer kapillærenderne inde i alle hætteglas på samme niveau for at undgå bias, der kunne opstå, hvis fødekilderne var placeret i forskellige højder (3 - 4 cm fra låget); holde afstand til filtreringspapiret for at forhindre kapillæren i at lække ved et uheld at røre ved filterpapiret eller forskellige viskositeter af fødekilder.
4. Mærke den øverste ende af den farvede væske ved hjælp af en tuschpen (mærke_begynder). For at sikre, at de forskellige kapillærer kan identificeres, skal du mærke dem individuelt ved hjælp af en farve- eller stribekode.
5. Placer flere forberedte CAFE-assays i en plastkasse med gitterindlæg, og overfør kassen (figur 2A) til en sikker position under laboratorieforhold eller i et temperatur-, lys- og fugtighedskontrolleret klimakammer (parametre: 25 °C, 60% relativ luftfugtighed, 12 h/12 h lys-mørk cyklus) i forsøgsperioden(f.eks. 3 timer eller dage).
6. Da bundfilterpapiret tørrer ud, hvis analysen udføres over flere dage, påføres ferskvand hver 24. Brug fire separate hætteglas (8 cm højde, 3,3 cm diameter) fyldt med 30 mL ddH₂O som fugtighed enheder og placere dem ved siden af CAFE assays i plastboksen. Brug et dæksel til plastboksen til at skabe fugtighedskontrollerede omgivelser under forsøget (Figur 2A).
   BEMÆRK: Der forekommer en bredere variation under laboratorieforhold. Det er dog muligt at udføre CAFE-analysen ved stuetemperatur(f.eks.i et klasseværelse). Brugen af en befugtningsanordning (filterpapir, med eller uden våd svamp bung, fyldte vandflasker og dæksel til plastboksen) opfordres kraftigt til at mindske fordampningen(figur 2B).
7. Udskift kapillærerne med friskfyldte til langtidsforsøg hver 24. time. Noter døde fluer før hvert 24 timers interval, og brug antallet af levende fluer til at beregne forbruget pr. Flue i den følgende periode. De gamle kapillærer kasseres efter at have målt nedgangen i menisken (se 2.1).
   BEMÆRK: Under et 3 timers eksperiment ser vi næppe nogen døde fluer. I løbet af en 4 dages undersøgelse finder vi normalt 1 - 3 døde fluer.
8. I slutningen af analysen eller før du udskifter kapillæren, skal du markere kapillærens nedre menisk (mark_end)med en tuschpen, mens CAFE-analysen stadig er i oprejst position. Slet dataene, hvis_{markeringsafslutningen} ikke er under startmærket (mærket_begynder). Fjern ikke låget, da dette kan ændre menisken.
9. Fjern forsigtigt kapillærerne fra analysen og gem dem til dataindsamling. Kontroller, om væsken inde i kapillæren nåede den nederste ende, hvis ikke kassér dataene, da mad ikke var tilgængelig for fluerne. Saml alle kapillærer pr. hætteglas som en gruppe. Indsæt uslebne pipettespidser i alle åbninger for at forhindre fluer i at undslippe. Demontere opsætningen og vask hætteglas, låg og svamp bungs i et sæbebad og tør natten over ved stuetemperatur til videre brug.
   BEMÆRK: Fluer kan analyseres yderligere efter analysen. Bekræft madoptagelse med øjet eller under et dissektionsmikroskop.
10. Gentag eksperimenter med de samme genotyper på mindst tre forskellige dage.

2. Dataindsamling og -analyse

1. Mål afstanden mellem_{markerings begyndelse} og_{mærkeafslutning} på kapillæren ved hjælp af en caliper eller en lineal. Hvis du vil overføre data direkte til et regneark, skal du bruge en USB-forbindelse (Universal Serial Bus), der er tilsluttet digital caliper (Figur 1E). Kassér kapillærerne efter målingen.
2. Konto for kapillær størrelse til at beregne madoptagelse eller fordampning. Overvej for eksempel en kapillær, der er 73 mm lang og indeholder 5 μL madopløsning. Et fald på 14,6 mm i menisken afspejler optagelsen af 1 μL opløsning. Beregn madoptagelse ved hjælp af følgende formel:
   Madoptagelse (μL) = målt afstand (mm)/ 14,6 mm
3. For at udelukke fordampningens virkning på fødeindtagelsen beregnes den gennemsnitlige fordampning i de tre (mindst) kontrolglas uden fluer. Træk denne middelværdi fra den værdi, fluerne opnåede til fødevareforbrug.
4. Brug følgende formel til at bestemme det samlede forbrug pr. flue:
   Fødevareforbrug (μL) = (Fødevareoptagelse [μL] - Fordampningstab [μL])/samlet antal fluer i hætteglasset. Til langsigtede eksperimenter skal du bruge antallet af fluer i live før starten af 24 timers intervallet.
5. For at tage højde for forskelle i kropsstørrelse, såsom mellem mandlige og kvindelige fluer, normalisere fødevareforbruget til kropsvægt (μL mad / mg flyve).
6. Brug statistisk software til dataanalyse. Til normalt distribuerede data skal du bruge elevens T-testtil at bestemme forskelle mellem to flyvegrupper og bruge ANOVA (analyse af varians) med post hoc Tukey Cramer-test for mere end to grupper. I en valgsituation skal du analysere forskelle fra tilfældigt valg ved hjælp af en ikke-parameterskilttest med én prøve.

Representative Results

Figur 1: Drosophila melanogaster CApillary FEeder Assay. A) Foderanalysen med fluer. Fugtet filterpapir giver vand i bunden af hætteglasset. Fire kapillærer leveres under eksperimentet (rød- og blåfarvet mad i modsatte kapillærer). Bemærk, at kapillærerne er fastgjort på plads med en anden pipettespids, og ubrugte positioner lukkes ved hjælp af pipettespidser. Et skumstik i midten af låget giver mulighed for luftudveksling. B) Detaljeret udsyn til låget. Skærepipettespidser (2 - 20 μL, røde kanter) indsættes i de koniske åbninger af ubrugte positioner, og en anden pipettespids indsættes i snitspidsen for at lukke hullet. De afskårne pipettespidser bruges til at styre placeringen af mikrokapillærerne, og uslebne spidser bruges til at holde kapillærerne stramme. C) En D. melanogaster flyve feeds på en kapillær. D) Efter fodring er madfarven tydeligt synlig i flyvelivet. E) En digital caliper bruges til at måle afstanden mellem mærke_begyndelse og mærke_slutningen af menisken. Dataene overføres direkte til et Excel-regneark via USB. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Fordampnings indflydelse i Kapillærfoderanalysen. A) Flere CAFE assay placeret inde i en plastikkasse med en gitter indlæg. Til styring af fugtigheden under eksperimentet placeres fire vandfyldte hætteglas (røde fælge) inde i gitteret. Fordampningskontrollerne er placeret i umiddelbar nærhed af disse hætteglas. Et omslag til hele opsætningen vises i baggrunden. B) Sammenligning af volumentabet ved fordampning. Middelværdien for fordampning over 4 dage vises. Fugtigheden styres af i) anvendelse af vand på den centrale svamp bung (24 timer interval); ii) tilsætning af fire vandfyldte hætteglas i nettet og (iii) ved hjælp af et plastdæksel til hele opsætningen. Fordampningen er betydeligt lavere, hvis luftfugtigheden styres for begge testede opløsninger (***P ≤ 0,001; N = 48). Ingen forskelle i volatiliteten mellem EtOH, der indeholder og ikke indeholder saccharoseopløsning, kan påvises med de anvendte fugtighedsanordninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL