Il saggio CApillary FEeder (CAFE): un metodo per tenere traccia del consumo e delle preferenze alimentari nella Drosophila

Overview

Questo video descrive il test CApillary FEeder, o CAFE, un metodo comportamentale che misura l'assunzione di cibo e la preferenza dei moscerini della frutta sfrenati. Il protocollo in primo piano mostra come eseguire il saggio con un'evaporazione minima dai capillari riempiti di liquido utilizzati per consegnare il cibo e monitorarne l'assunzione.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Assemblaggio ed esecuzione del saggio FEeder CApillary

1. Se il digiuno non è necessario, trasferire le mosche sperimentali al saggio maschiando o soffiando." Assicurati di includere tre fiale di controllo senza mosche per quantificare l'evaporazione.
2. Rimuovere con cura una punta di pipetta (2 - 20 μL di volume) che sta chiudendo una delle aperture esterne e inserire prima un capillare di vetro riempito, dall'estremità inferiore. Fissare il capillare posizionando la punta della pipetta accanto al capillare. Se sono in fase di test diverse soluzioni alimentari, ripetere questa procedura di conseguenza.
3. Posizionare le estremità capillari all'interno di tutte le fiale allo stesso livello per evitare distorsioni che potrebbero verificarsi se le fonti di cibo si trovavano a diverse altezze (3 - 4 cm dal coperchio); mantenere una distanza dalla carta filtrante per evitare che il capillare perda toccando accidentalmente la carta filtrante o diverse viscosità delle fonti alimentari.
4. Etichettare l'estremità superiore del liquido colorato utilizzando una penna marcatore (inizio_contrassegno). Per garantire che i diversi capillari possano essere identificati, etichettarli singolarmente utilizzando un colore o un codice a strisce.
5. Posizionare più test CAFE preparati all'interno di una scatola di plastica con intarsio grigliato e trasferire la scatola (Figura 2A) in una posizione sicura in condizioni di laboratorio o in una camera climatica climatmente controllata da temperatura, luce e umidità (parametri: 25 °C, 60% di umidità relativa, 12 h /12 h di ciclo luce-buio) per il periodo sperimentale(ad esempio 3 ore o giorni).
6. Man mano che la carta filtrante inferiore si asciuga se il dosaggio viene eseguito per diversi giorni, applicare acqua dolce ogni 24 ore tramite il bung di spugna (100 μL) per mantenere costante l'umidità all'interno del saggio. Utilizzare quattro flaconcini separati (altezza 8 cm, diametro 3,3 cm) riempiti con 30 mL ddH₂O come dispositivi di umidità e posizionarli accanto ai test CAFE nella scatola di plastica. Utilizzare un coperchio per la scatola di plastica per creare un ambiente controllato dall'umidità durante l'esperimento (Figura 2A).
   NOTA: Una variabilità più ampia si verifica in condizioni di laboratorio; tuttavia, è possibile eseguire il saggio CAFE a temperatura ambiente(ad esempio,in classe). L'uso di un dispositivo di umidificazione (carta filtrante, con o senza bung di spugna bagnata, flaconcini d'acqua riempiti e coperchio per la scatola di plastica) è altamente incoraggiato a ridurre l'evaporazione(figura 2B).
7. Sostituire i capillari con quelli appena riempiti per esperimenti a lungo termine ogni 24 ore. Prendere nota delle mosche morte prima di ogni intervallo di 24 ore e utilizzare il numero di mosche vive per calcolare il consumo per mosca per il periodo successivo. Scartare i vecchi capillari dopo aver misurato il declino del menisco (vedi 2.1).
   NOTA: Durante un esperimento di 3 ore non vediamo quasi nessuna mosca morta. Durante uno studio di 4 giorni di solito troviamo 1 - 3 mosche morte.
8. Alla fine del saggio o prima di sostituire il capillare, contrassegnare il menisco inferiore del capillare (estremità del_segno)con una pennarello mentre il saggio CAFE è ancora in posizione verticale. Ignorare i dati se la fine_{del contrassegno} non è inferiore al segno iniziale (inizio_contrassegno). Non rimuovere il coperchio, in quanto ciò potrebbe cambiare il menisco.
9. Rimuovere con cura i capillari dal saggio e conservarli per la raccolta dei dati. Controllare se il liquido all'interno del capillare ha raggiunto l'estremità inferiore se non scartare i dati, poiché il cibo non era accessibile alle mosche. Raccogliere tutti i capillari per fiala in gruppo. Inserire punte di pipetta non tagliate in tutte le aperture per evitare che le mosche fuoriemerano. Smontare la configurazione e lavare fiale, coperchi e panetti di spugna in un bagno di sapone e asciugare durante la notte a temperatura ambiente per un ulteriore utilizzo.
   NOTA: Le mosche possono essere ulteriormente analizzate dopo il saggio. Confermare l'assorbimento del cibo a occhio o al microscopio a dissezione.
10. Ripetere gli esperimenti con gli stessi genotipi in almeno tre giorni diversi.

2. Raccolta e analisi dei dati

1. Misurare la distanza tra_{l'inizio del} segno e_{la fine} del contrassegno sul capillare utilizzando una pinza o un righello. Per trasferire i dati direttamente in un foglio di calcolo, utilizzare una pinza digitale connessa USB (Universal Serial Bus) (Figura 1E). Scartare i capillari dopo la misurazione.
2. Tenere conto delle dimensioni capillari per calcolare l'assorbimento o l'evaporazione degli alimenti. Ad esempio, si consideri un capillare lungo 73 mm e contenente 5 μL di soluzione alimentare. Una diminuzione di 14,6 mm nel menisco riflette l'assorbimento di 1 μL di soluzione. Calcolare l'assorbimento di cibo utilizzando la formula seguente:
   Assorbimento alimentare (μL) = distanza misurata (mm)/ 14,6 mm
3. Per escludere l'effetto dell'evaporazione sull'assunzione di cibo, calcolare l'evaporazione media nelle tre fiale di controllo (al minimo) senza mosche. Sottrarre questo valore medio dal valore ottenuto per il consumo alimentare dalle mosche.
4. Utilizzare la formula seguente per determinare il consumo totale per volo:
   Consumo alimentare (μL) = (assorbimento alimentare [μL] - Perdita evaporativa [μL])/numero totale di mosche nel flaconcino. Per esperimenti a lungo termine utilizzare il numero di mosche vive prima dell'inizio dell'intervallo di 24 ore.
5. Per tenere conto delle differenze nelle dimensioni del corpo, come tra mosche maschili e femmine, normalizza il consumo di cibo in peso corporeo (μL cibo / mg mosca).
6. Utilizzare software statistico per l'analisi dei dati. Per i dati normalmente distribuiti, utilizzare i test T dello studenteper determinare le differenze tra due gruppi di volo e utilizzare ANOVA (analisi della varianza) con test Tukey Cramer post hoc per più di due gruppi. In una situazione di scelta, analizzare le differenze rispetto alla scelta casuale utilizzando un test di segno di un campione non parametrico.

Representative Results

Figura 1: Il saggio Drosophila melanogaster CApillary FEeder. A) Il saggio di alimentazione con le mosche. La carta filtrante inumidita fornisce acqua nella parte inferiore del flaconcino. Durante l'esperimento vengono forniti quattro capillari (cibo di colore rosso e blu in capillari opposti). Si noti che i capillari sono fissati in posizione da una seconda punta di pipetta e le posizioni inutilizzate vengono chiuse utilizzando punte di pipetta. Una spina di schiuma al centro del coperchio consente lo scambio d'aria. B) Vista dettagliata del coperchio. Le punte delle pipette tagliate (2 - 20 μL, bordi rossi) vengono inserite nelle aperture coniche delle posizioni inutilizzate e una seconda punta della pipetta viene inserita nella punta di taglio per chiudere il foro. Le punte delle pipette tagliate vengono utilizzate per controllare il posizionamento dei microcapillari e le punte non tagliate vengono utilizzate per tenere stretti i capillari. C) Una mosca D. melanogaster si nutre di un capillare. D) Dopo l'alimentazione, il colore del cibo è chiaramente visibile nell'addome della mosca. E) Una pinza digitale viene utilizzata per misurare la distanza tra l'inizio_{del segno} e_{la fine} del menisco. I dati vengono trasferiti direttamente su un foglio di calcolo Excel tramite USB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Influenza dell'evaporazione nel saggio dell'alimentatore capillare. A) Più test CAFE posizionati all'interno di una scatola di plastica con un intarsio a griglia. Per controllare l'umidità durante l'esperimento vengono posizionate all'interno della griglia quattro flaconcini riempiti d'acqua (cerchi rossi). I comandi di evaporazione sono posizionati in prossimità diretta di queste fiale. Sullo sfondo viene visualizzata una copertina per l'intera configurazione. B) Confronto della perdita di volume per evaporazione. Viene mostrato il valore medio per l'evaporazione su 4 giorni. L'umidità è controllata da (i) applicare acqua al bung centrale della spugna (intervallo di 24 ore); — l'aggiunta di quattro flaconcini riempiti d'acqua nella rete; e (iii) utilizzando un coperchio di plastica per l'intera configurazione. L'evaporazione è significativamente inferiore se l'umidità è controllata per entrambe le soluzioni testate (***P ≤ 0,001; N = 48). Nessuna differenza di volatilità tra la soluzione di saccarosio contenente EtOH e la soluzione di saccarosio non contenitore è rilevabile con i dispositivi di umidità utilizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL