Der CApillary FEeder (CAFE) Assay: Eine Methode, um den Verzehr von Lebensmitteln und die Präferenz in Drosophila zu verfolgen

Overview

Dieses Video beschreibt den CApillary FEeder, oder CAFE, Assay, eine Verhaltensmethode, die die Nahrungsaufnahme und die Präferenz von hemmungslosen Fruchtfliegen misst. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie der Test mit minimaler Verdunstung von den flüssigkeitsgefüllten Kapillaren durchgeführt wird, die verwendet werden, um das Essen zu liefern und seine Aufnahme zu verfolgen.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montage und Durchführung des CApillar-FEeder-Assays

1. Wenn kein Fasten erforderlich ist, übertragen Sie die experimentellen Fliegen auf den Test durch Tippen oder durch Blasrohr. Achten Sie darauf, drei Steuerfläschchen ohne Fliegen enthalten, um die Verdunstung zu quantifizieren.
2. Entfernen Sie vorsichtig eine Pipettenspitze (2 - 20 L Volumen), die eine der äußeren Öffnungen schließt, und legen Sie zuerst eine gefüllte Glaskapillare am unteren Ende ein. Sichern Sie die Kapillare, indem Sie die Pipettenspitze wieder neben die Kapillare stellen. Wenn mehrere Lebensmittellösungen getestet werden, wiederholen Sie dieses Verfahren entsprechend.
3. Platzieren Sie die Kapillarenen in allen Durchstechflaschen auf der gleichen Ebene, um Verzerrungen zu vermeiden, die auftreten könnten, wenn sich die Nahrungsquellen in unterschiedlichen Höhen (3 - 4 cm vom Deckel entfernt) befinden; Halten Sie Abstand zum Filterpapier, um zu verhindern, dass die Kapillare austritt, indem Sie versehentlich das Filterpapier oder verschiedene Viskositäten von Nahrungsquellen berühren.
4. Beschriften Sie das obere Ende der farbigen Flüssigkeit mit einem Markerstift_{(Markierungsbeginn}). Um sicherzustellen, dass die verschiedenen Kapillaren identifiziert werden können, beschriften Sie sie einzeln mit einem Farb- oder Streifencode.
5. Mehrere vorbereitete CAFE-Assays in eine Kunststoffbox mit gerasterter Inlay legen und die Box (Abbildung 2A) für den Versuchszeitraum (z.B. 3 h oder Tage) an eine sichere Position unter Laborbedingungen(z.B. 3 h oder Tage) übertragen.
6. Da das Bodenfilterpapier austrocknet, wenn der Test über mehrere Tage durchgeführt wird, wenden Sie ihr Frischewasser alle 24 stunden über den Schwamm-Bung (100 l) an, um die Luftfeuchtigkeit im Test konstant zu halten. Verwenden Sie vier separate Fläschchen (8 cm Höhe, 3,3 cm Durchmesser), gefüllt mit 30 ml ddH₂O als Feuchtigkeitsgeräte und legen Sie sie neben die CAFE-Assays in die Kunststoffbox. Verwenden Sie eine Abdeckung für die Kunststoffbox, um während des Experiments eine feuchtigkeitsgesteuerte Umgebung zu schaffen (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Breitere Variabilität tritt unter Laborbedingungen auf; Es ist jedoch möglich, den CAFE-Assay bei Raumtemperatur(z.B.in einem Klassenzimmer) durchzuführen. Die Verwendung einer Befeuchtungsvorrichtung (Filterpapier, mit oder ohne nassen Schwammbung, gefüllte Wasserfläschchen und Abdeckung für die Kunststoffbox) wird dringend gefördert, um die Verdunstung zu verringern (Abbildung 2B).
7. Ersetzen Sie die Kapillaren alle 24 Stunden durch frisch gefüllte für Langzeitexperimente. Notieren Sie sich tote Fliegen vor jedem 24-Stunden-Intervall und verwenden Sie die Anzahl der lebenden Fliegen, um den Verbrauch pro Flug für den folgenden Zeitraum zu berechnen. Entsorgen Sie die alten Kapillaren, nachdem Sie den Rückgang des Meniskus gemessen haben (siehe 2.1).
   HINWEIS: Bei einem 3-Stunden-Experiment sehen wir kaum tote Fliegen. Während einer 4-tägigen Studie finden wir in der Regel 1 - 3 tote Fliegen.
8. Am Ende des Assays oder vor dem Ersetzen der Kapillare den unteren Meniskus der Kapillare_{(Markierungsende}) mit einem Markerstift markieren, während sich der CAFE-Assay noch in aufrechter Position befindet. Verwerfen Sie die Daten, wenn das_{Markierungsende} nicht unter der Anfangsmarke_{(Markierungsbeginn)}liegt. Entfernen Sie den Deckel nicht, da dies den Meniskus verändern könnte.
9. Entfernen Sie die Kapillaren vorsichtig aus dem Assay und speichern Sie sie für die Datenerfassung. Prüfen Sie, ob die Flüssigkeit in der Kapillare das untere Ende erreicht hat, wenn sie die Daten nicht verwirft, da die Nahrung für die Fliegen nicht zugänglich war. Sammeln Sie alle Kapillaren pro Durchstechflasche als Gruppe. Legen Sie ungeschnittene Pipettenspitzen in alle Öffnungen ein, um zu verhindern, dass Fliegen entkommen. Demontieren Sie das Setup und waschen Sie die Fläschchen, Deckel und Schwamm-Bungs in einem Seifenbad und trocknen Sie über Nacht bei Raumtemperatur für den weiteren Gebrauch.
   HINWEIS: Fliegen können nach dem Test weiter analysiert werden. Bestätigen Sie die Nahrungsaufnahme mit dem Auge oder unter einem Seziermikroskop.
10. Wiederholen Sie Experimente mit den gleichen Genotypen an mindestens drei verschiedenen Tagen.

2. Datenerhebung und -analyse

1. Messen Sie den Abstand zwischen Dem_strich- und dem_{Markierungsende} auf der Kapillare mit einem Bremssattel oder einem Lineal. Um Daten direkt in eine Kalkulationstabelle zu übertragen, verwenden Sie einen USB (Universal Serial Bus) angeschlossenen digitalen Bremssattel (Abbildung 1E). Entsorgen Sie die Kapillaren nach der Messung.
2. Berücksichtigen Sie die Kapillargröße zur Berechnung der Nahrungsaufnahme oder Verdunstung. Betrachten Sie beispielsweise eine Kapillare, die 73 mm lang ist und 5 l Lebensmittellösung enthält. Eine Abnahme des Meniskus um 14,6 mm spiegelt die Aufnahme von 1 l Lösung wider. Berechnen Sie die Nahrungsaufnahme nach folgender Formel:
   Nahrungsaufnahme (l) = gemessener Abstand (mm)/ 14,6 mm
3. Um die Auswirkungen der Verdunstung auf die Nahrungsaufnahme auszuschließen, berechnen Sie die mittlere Verdunstung in den drei (mindestens) Kontrollfläschchen ohne Fliegen. Subtrahieren Sie diesen Mittelwert von dem Wert, der von den Fliegen für den Lebensmittelverbrauch erhalten wird.
4. Verwenden Sie die folgende Formel, um den Gesamtverbrauch pro Flug zu bestimmen:
   Lebensmittelverbrauch (L) = (Lebensmittelaufnahme [L] - Verdunstungsverlust [L])/Gesamtanzahl der Fliegen in der Durchstechflasche. Für Langzeitexperimente verwenden Sie die Anzahl der fliegenlebend vor dem Beginn des 24 h Intervalls.
5. Um Unterschiede in der Körpergröße, z. B. zwischen männlichen und weiblichen Fliegen, zu berücksichtigen, normalisieren Sie den Nahrungsverbrauch auf das Körpergewicht (L Lebensmittel/mg-Fliege).
6. Verwenden Sie statistische Software für die Datenanalyse. Verwenden Sie für normal verteilte Daten die T-Testsder Schüler, um Unterschiede zwischen zwei Fliegengruppen zu ermitteln, und verwenden Sie ANOVA (Varianzanalyse) mit Post-hoc-Tukey-Cramer-Tests für mehr als zwei Gruppen. Analysieren Sie in einer Auswahlsituation Unterschiede zur zufälligen Auswahl mithilfe eines nicht parametrischen Ein-Beispiel-Zeichentests.

Representative Results

Abbildung 1: Der Drosophila melanogaster CApillary FEeder Assay. A) Der Fütterungstest mit Fliegen. Befeuchtetes Filterpapier liefert Wasser am Boden der Durchstechflasche. Während des Experiments werden vier Kapillaren bereitgestellt (rot- und blau gefärbte Lebensmittel in gegenüberliegenden Kapillaren). Beachten Sie, dass die Kapillaren durch eine zweite Pipettenspitze in Position gesichert sind und ungenutzte Positionen mit Pipettenspitzen geschlossen werden. Ein Schaumstoffstecker in der Mitte des Deckels ermöglicht den Luftaustausch. B) Detailansicht des Deckels. Schnittpipettenspitzen (2 - 20 L, rote Ränder) werden in die konischen Öffnungen ungenutzter Positionen eingesetzt, und eine zweite Pipettenspitze wird in die geschnittene Spitze eingeführt, um das Loch zu schließen. Die geschnittenen Pipettenspitzen werden verwendet, um die Platzierung der Mikrokapillaren zu steuern, und ungeschnittene Spitzen werden verwendet, um die Kapillaren fest zu halten. C) Eine D. melanogaster Fliege ernährt sich von einer Kapillare. D) Nach der Fütterung ist die Futterfarbe im Fliegenbauch deutlich sichtbar. E) Ein digitaler Bremssattel wird verwendet, um den Abstand zwischen dem_Markenbeginn und dem_Markenende des Meniskus zu messen. Die Daten werden über USB direkt in eine Excel-Tabelle übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einfluss der Verdunstung im Kapillar-Feeder-Assay. A) Mehrere CAFE-Assay in einer Kunststoffbox mit einem gegitterten Inlay platziert. Zur Kontrolle der Luftfeuchtigkeit während des Experiments werden vier wassergefüllte Fläschchen (rote Felgen) in das Gitter gelegt. Die Verdampfungssteuerungen werden in unmittelbarer Nähe zu diesen Durchstechflaschen platziert. Im Hintergrund wird eine Abdeckung für das gesamte Setup angezeigt. B) Vergleich des Volumenverlustes durch Verdunstung. Der Mittelwert für die Verdunstung über 4 Tage wird angezeigt. Die Luftfeuchtigkeit wird durch (i) das Auftragen von Wasser auf die zentrale Schwamm-Bung (24 h Intervall) gesteuert; ii) Hinzufügen von vier mit Wasser gefüllten Durchstechflaschen in das Gitter; und (iii) verwendung einer Kunststoffabdeckung für das gesamte Setup. Die Verdunstung ist deutlich geringer, wenn die Luftfeuchtigkeit für beide getesteten Lösungen gesteuert wird (***P ≤ 0,001; N = 48). Bei den verwendeten Feuchtigkeitsgeräten sind keine Unterschiede in der Volatilität zwischen EtOH-haltiger und nicht enthaltender Saccharoselösung erkennbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL