O Ensaio CApillary FEeder (CAFE): Um método para acompanhar o consumo e preferência dos alimentos em Drosophila

Overview

Este vídeo descreve o CApillary FEeder, ou CAFE, ensaio, um método comportamental que mede a ingestão de alimentos e a preferência de moscas de frutas sem restrições. O protocolo em destaque mostra como realizar o ensaio com evaporação mínima dos capilares cheios de líquido usados para entregar o alimento e acompanhar sua ingestão.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montagem e Execução do Ensaio FApillary FEeder

1. Se o jejum não for necessário, transfira as moscas experimentais para o ensaio tocando ou por cano-de-sopro. Certifique-se de incluir três frascos de controle sem moscas para quantificar a evaporação.
2. Remova cuidadosamente uma ponta de pipeta (2 - 20 μL de volume) que está fechando uma das aberturas externas, e insira um vidro recheado capilar, primeiro de fundo. Fixar o capilar colocando a ponta da pipeta de volta ao lado do capilar. Se várias soluções alimentares estiverem sendo testadas, repita este procedimento em conformidade.
3. Coloque as extremidades capilares dentro de todos os frascos no mesmo nível para evitar viés que poderia ocorrer se as fontes de alimento estivessem localizadas em alturas diferentes (3 - 4 cm da tampa); manter uma distância do papel filtro para evitar que o capilar vaze tocando acidentalmente o papel do filtro ou diferentes viscosidades das fontes de alimentos.
4. Rotule a extremidade superior do líquido colorido usando uma caneta marcadora_(inícioda marca ). Para garantir que os diferentes capilares possam ser identificados, rotule-os individualmente usando um código de cor ou listra.
5. Coloque vários ensaios de CAFÉ preparados dentro de uma caixa de plástico com inlay gridded e transfira a caixa(Figura 2A) para uma posição segura em condições laboratoriais ou em uma câmara climática controlada por temperatura, luz e umidade (parâmetros: 25 °C, 60% de umidade relativa, 12 h/12 h ciclo claro-escuro) para o período experimental(por exemplo, 3h ou dias).
6. À medida que o papel do filtro inferior seca se o ensaio for realizado ao longo de vários dias, aplique água doce a cada 24 horas através da esponja bung (100 μL) para manter a umidade constante dentro do ensaio. Use quatro frascos separados (8 cm de altura, 3,3 cm de diâmetro) preenchidos com 30 mL ddH₂O como dispositivos de umidade e coloque-os ao lado dos ensaios CAFE na caixa de plástico. Use uma tampa para a caixa de plástico para criar ambiente controlado pela umidade durante o experimento(Figura 2A).
   NOTA: A variabilidade mais ampla ocorre em condições laboratoriais; no entanto, é viável realizar o ensaio CAFE em temperatura ambiente (por exemplo,em sala de aula). O uso de um dispositivo de umidificação (papel filtro, com ou sem uma esponja molhada, frascos de água escoados e tampa para a caixa de plástico) é altamente incentivado a diminuir a evaporação(Figura 2B).
7. Substitua os capilares por recém-preenchidos para experimentos de longo prazo a cada 24 horas. Anote as moscas mortas antes de cada intervalo de 24 horas e use o número de moscas vivas para calcular o consumo por mosca para o período seguinte. Descarte os capilares antigos depois de medir o declínio do menisco (ver 2.1).
   NOTA: Durante um experimento de 3 horas, quase não vemos moscas mortas. Durante um estudo de 4 dias, geralmente encontramos 1-3 moscas mortas.
8. No final do ensaio ou antes de substituir o capilar, marque o menisco inferior do capilar_(extremidadeda marca ) com uma caneta marcadora enquanto o ensaio CAFE ainda está na posição vertical. Descarte os dados se a_extremidade da marca não estiver abaixo da marca inicial_(inícioda marca ). Não remova a tampa, pois isso pode mudar o menisco.
9. Remova cuidadosamente os capilares do ensaio e armazene-os para coleta de dados. Verifique se o líquido dentro do capilar atingiu a extremidade inferior se não descartar os dados, pois os alimentos não eram acessíveis às moscas. Colete todos os capilares por frasco como um grupo. Insira pontas de pipeta sem cortes em todas as aberturas para evitar que as moscas escapem. Desmonte a configuração e lave os frascos, tampas e esponjas em um banho de sabão e seque durante a noite à temperatura ambiente para uso posterior.
   NOTA: Moscas podem ser analisadas após o ensaio. Confirme a absorção de alimentos por olho ou sob um microscópio de dissecção.
10. Repita experimentos com os mesmos genótipos em pelo menos três dias diferentes.

2. Coleta e Análise de Dados

1. Meça a distância entre_{o início} da marca e a_extremidade da marca no capilar usando uma pinça ou uma régua. Para transferir dados diretamente para uma planilha, use uma pinça digital conectada USB (Universal Serial Bus)(Figura 1E). Descarte os capilares após a medição.
2. Conta o tamanho capilar para calcular a absorção ou evaporação dos alimentos. Por exemplo, considere um capilar que tem 73 mm de comprimento e contém 5 μL de solução alimentar. Uma redução de 14,6 mm no menisco reflete a absorção de solução de 1 μL. Calcular a absorção de alimentos usando a seguinte fórmula:
   Absorção de alimentos (μL) = distância medida (mm)/ 14,6 mm
3. Para excluir o efeito da evaporação na ingestão de alimentos, calcule a evaporação média nos frascos de controle de três (no mínimo) sem moscas. Subtraia esse valor médio do valor obtido para o consumo alimentar pelas moscas.
4. Use a seguinte fórmula para determinar o consumo total por mosca:
   Consumo de alimentos (μL) = (Captação de alimentos [μL] - Perda evaporativa [μL])/número total de moscas no frasco. Para experimentos de longo prazo, use o número de moscas vivas antes do início do intervalo de 24 horas.
5. Para explicar as diferenças no tamanho do corpo, como entre moscas machos e fêmeas, normalizar o consumo de alimentos ao peso corporal (μL food/mg fly).
6. Use software estatístico para análise de dados. Para dados normalmente distribuídos, use os testes Tdo aluno para determinar diferenças entre dois grupos de moscas e use ANOVA (análise de variância) com testes pós-hoc Tukey Cramer para mais de dois grupos. Em uma situação de escolha, analise as diferenças da escolha aleatória usando um teste de sinal de uma amostra não paramétrico.

Representative Results

Figura 1: O Drosophila melanogaster CApillary FEeder Assay. A) O ensaio de alimentação com moscas. O papel filtro umedecido fornece água na parte inferior do frasco. Quatro capilares são fornecidos durante o experimento (alimentos vermelhos e azuis em capilares opostos). Observe que os capilares são fixados na posição por uma segunda ponta de pipeta, e as posições não aproveitadas são fechadas usando pontas de pipeta. Um plugue de espuma no centro da tampa permite a troca de ar. B) Visão detalhada da tampa. As pontas de pipeta cortadas (2 - 20 μL, bordas vermelhas) são inseridas nas aberturas cônicas de posições não uso, e uma segunda ponta de pipeta é inserida na ponta de corte para fechar o orifício. As pontas de pipeta cortadas são usadas para controlar a colocação dos microcapillaries, e pontas sem cortes são usadas para manter os capilares apertados. C) Uma mosca D. melanogaster se alimenta de um capilar. D) Após a alimentação, a cor dos alimentos é claramente visível no abdômen da mosca. E) Uma pinça digital é usada para medir a distância entre o_início da marca e o_fim da marca do menisco. Os dados são transferidos diretamente para uma planilha do Excel via USB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Influência da Evaporação no Ensaio alimentador capilar. A) Ensaio de vários cafés colocado dentro de uma caixa de plástico com uma incrustação gridded. Para controlar a umidade durante o experimento, quatro frascos cheios de água (bordas vermelhas) são colocados dentro da grade. Os controles de evaporação são colocados em proximidade direta com esses frascos. Uma capa para toda a configuração é mostrada em segundo plano. B) Comparação da perda de volume através da evaporação. O valor médio para evaporação ao longo de 4 dias é mostrado. A umidade é controlada por (i) aplicação de água na esponja central bung (intervalo de 24h); (ii) adicionar quatro frascos cheios de água na rede; e (iii) usando uma tampa plástica para toda a configuração. A evaporação é significativamente menor se a umidade for controlada para ambas as soluções testadas (***P ≤ 0,001; N = 48). Nenhuma diferença de volatilidade entre a solução de sacarose contendo e não contendo etsues é detectável com os dispositivos de umidade utilizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL