CApillary FEeder (CAFE) Analys: En metod för att spåra matkonsumtion och preferens i Drosophila

Overview

Den här videon beskriver CApillary FEeder, eller CAFE, analys, en beteendemetod som mäter matintag och preferens av obegränsade fruktflugor. Det presenterade protokollet visar hur man utför analysen med minimal avdunstning från de vätskefyllda kapillärerna som används för att leverera maten och spåra dess intag.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montering och utföra CApillary FEeder-analys

1. Om fasta inte behövs, överför de experimentella flugorna till analysen genom att knacka eller med blåsrör. Se till att inkludera tre kontroll injektionsflaska utan flugor för att kvantifiera avdunstning.
2. Ta försiktigt bort en pipettspets (2 - 20 μL volym) som stänger en av de yttre öppningarna och sätt in ett fyllt glas kapillär, bottenden först. Fäst kapillären genom att placera tillbaka pipettspetsen bredvid kapillären. Om flera livsmedelslösningar testas, upprepa detta förfarande i enlighet därmed.
3. Placera kapillärändarna inuti alla injektionsflaskan på samma nivå för att undvika partiskhet som kan uppstå om matkällorna var placerade på olika höjder (3 - 4 cm från locket); håll avstånd till filterpapperet för att förhindra att kapillären läcker genom att oavsiktligt vidröra filterpapperet eller olika viskositeter hos livsmedelskällor.
4. Märk den övre änden av den färgade vätskan med hjälp av en markörpenna (markera_början). För att säkerställa att de olika kapillärerna kan identifieras, märk dem individuellt med hjälp av en färg- eller randkod.
5. Placera flera förberedda CAFE-analyser inuti en plastlåda med gallerinlägg och överför lådan(figur 2A)till ett säkert läge under laboratorieförhållanden eller i en temperatur-, ljus- och fuktighetsstyrd klimatkammare (parametrar: 25 °C, 60% relativ fuktighet, 12 h/12 h ljus-mörk cykel) för försöksperioden(t.ex. 3 h eller dagar).
6. När bottenfilterpapper torkar ut om analysen utförs under flera dagar, applicera färskvatten var 24: e timme via svampen bung (100 μL) för att hålla fuktigheten konstant inuti analysen. Använd fyra separata injektionsflaskor (8 cm höjd, 3,3 cm diameter) fyllda med 30 ml ddH₂O som fuktighetsanordningar och placera dem bredvid CAFE-analyserna i plastlådan. Använd ett lock till plastlådan för att skapa fuktstyrd miljö under försöket (figur 2A).
   OBS: Bredare variabilitet sker under laboratorieförhållanden. Det är dock möjligt att utföra CAFE-analysen vid rumstemperatur(t.ex.i ett klassrum). Användningen av en befuktningsanordning (filterpapper, med eller utan våt svamp bung, fyllda vattenflaskor och lock för plastlådan) uppmuntras starkt att minska avdunstningen (figur 2B).
7. Byt ut kapillärerna mot nyfyllda för långtidsexperiment var 24:e timme. Notera döda flugor före varje 24 timmars intervall och använd antalet levande flugor för att beräkna förbrukningen per fluga under följande period. Kassera de gamla kapillärerna efter att ha mätt meniskens nedgång (se 2.1).
   OBS: Under ett 3 h experiment ser vi knappt några döda flugor. Under en 4 dagars studie hittar vi vanligtvis 1 - 3 döda flugor.
8. Markera kapillärens nedre menisk (markslut)med en markörpenna medan CAFE-analysen fortfarande är i upprätt läge i slutet av analysen eller innan kapillären byts ut. Ignorera data om markslut_inte är under det ursprungliga märket (markera_början). Ta inte bort locket, eftersom det kan ändra menisken.
9. Ta försiktigt bort kapillärerna från analysen och lagra dem för datainsamling. Kontrollera om vätskan inuti kapillären nådde den nedre änden om den inte kasserade data, eftersom mat inte var tillgänglig för flugorna. Samla alla kapillärer per flaska som grupp. Sätt in oklippta pipettspetsar i alla öppningar för att förhindra att flugor läcker ut. Demontera installationen och tvätta injektionsflaskan, locken och svampbullarna i ett tvålbad och torka över natten vid rumstemperatur för vidare användning.
   OBS: Flugor kan analyseras ytterligare efter analysen. Bekräfta matupptaget med ögat eller under ett dissekeringsmikroskop.
10. Upprepa experiment med samma genotyper på minst tre olika dagar.

2. Insamling och analys av uppgifter

1. Mät avståndet mellan markstart_{och markeringsslut} på kapillären med en bromsok eller linjal. Om du vill överföra data direkt till ett kalkylblad använder du en USB-ansluten digital bromsok (bild1E). Kassera kapillärerna efter mätningen.
2. Ta hänsyn till kapillärstorlek för att beräkna matupptag eller avdunstning. Tänk till exempel på en kapillär som är 73 mm lång och innehåller 5 μL livsmedelslösning. En 14,6 mm minskning av menisken återspeglar upptaget av 1 μL-lösning. Beräkna matupptag med följande formel:
   Livsmedelsupptag (μL) = uppmätt avstånd (mm)/ 14,6 mm
3. För att utesluta effekten av avdunstning på matintaget, beräkna genomsnittlig avdunstning i de tre (åtminstone) kontrollflaskan utan flugor. Subtrahera detta medelvärde från det värde som erhålls för matkonsumtion av flugorna.
4. Använd följande formel för att bestämma den totala förbrukningen per fluga:
   Livsmedelskonsumtion (μL) = (Livsmedelsupptag [μL] - Avdunstningsförlust [μL])/totalt antal flugor i injektionsflaskan. För långsiktiga experiment använder du antalet flugor levande före början av 24 h-intervallet.
5. För att ta hänsyn till skillnader i kroppsstorlek, såsom mellan manliga och kvinnliga flugor, normalisera matkonsumtionen till kroppsvikt (μL mat / mgfluga).
6. Använd statistisk programvara för dataanalys. För normalt distribuerade data använder du studentens T-testerför att fastställa skillnader mellan två fluggrupper och använder ANOVA (analys av varians) med post hoc Tukey Cramer-tester för mer än två grupper. I en valsituation analyserar du skillnader från slumpval med hjälp av ett icke-parametriskt teckentest med ett exempel.

Representative Results

Figur 1: Drosophila melanogaster CApillary Feeder-analysen. A) Matningsanalysen med flugor. Fuktat filterpapper ger vatten i botten av injektionsflaskan. Fyra kapillärer tillhandahålls under experimentet (röd- och blåfärgad mat i motsatta kapillärer). Observera att kapillärerna är säkrade på plats med en andra pipettspets, och oanvända lägen stängs med pipettspetsar. En skumplugg i mitten av locket möjliggör luftutbyte. B) Detaljerad vy över locket. Skär pipettspetsar (2 - 20 μL, röda kanter) sätts in i de koniska öppningarna i oanvända lägen och en andra pipettspets sätts in i skärspetsen för att stänga hålet. De skurna pipettspetsarna används för att styra placeringen av mikrokapillärerna, och oklippta spetsar används för att hålla kapillärerna tätt. C) En D. melanogasterfluga matar på en kapillär. D) Efter utfodring är matfärgen tydligt synlig i flug buken. E) En digital bromsok används för att mäta avståndet mellan_{markstart och} meniskens ände. Data överförs direkt till ett Excel-kalkylblad via USB. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Påverkan av avdunstning i kapillärmataranalysen. A) Flera CAFE-analyser placerade i en plastlåda med ett gallrat inlägg. För att kontrollera luftfuktigheten under experimentet placeras fyra vattenfyllda injektionsflaska (röda fälgar) inuti gallret. Avdunstningsreglagen placeras i direkt närhet till dessa injektionsflaskar. Ett omslag för hela installationen visas i bakgrunden. B) Jämförelse av volymförlusten genom avdunstning. Medelvärdet för avdunstning under 4 dagar visas. Luftfuktigheten styrs av i) applicering av vatten på den centrala svampen bung (24 h intervall); ii) tillsätta fyra vattenfyllda injektionsflaskar i nätet, och iii) använda ett plastskydd för hela installationen. Avdunstningen är betydligt lägre om luftfuktigheten kontrolleras för båda lösningarna som testats (***P ≤ 0,001; N = 48). Inga skillnader i volatilitet mellan EtOH-innehållande och icke-innehållande sackaroslösning kan upptäckas med de fuktighetsanordningar som används. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vials (breeding)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay	Workshop	–	–
Plastic box, low wall	Plastime	353	www.plastime.it
Cover for the plastic box	Workshop	–	–
Capillaries	BLAUBRAND	REF 7087 07	www.brand.de
Pipette tips	Greiner Bio-One	771290	www.greinerbioone.com
Filter paper circles	Whatman	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose	AppliChem	57-50-1	www.applichem.com
Ethanol absolute	VWR Chemicals	20,821,330	www.vwr.com
Food color (red, E124)	Backfun	10027	www.backfun.de
Food color (blue, E133)	Backfun	10030	www.backfun.de
Soap solution (CVK 8)	CVH	103220	www.cvh.de
Digital caliper	GARANT	412,616	www.hoffmann-group.com
Vials (breeding)			Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm
Vials (CAFE assay)			Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay			Produced in university workshop, technical drawing supplied Please click here to download this file.
Plastic box, low wall			A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions
Cover for the plastic box			Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries			DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips			Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles			45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose			Not harmful
Ethanol absolute			Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124)			Not stated
Food color (blue, E133)			Not stated
Soap solution (CVK 8)			Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food			(for 20 L)
Agar			160 g
Brewer's Yeast			299.33 g
Cornmeal			1,200 g
Molasses			1.6 L
Propionic acid			57.3 mL
Nipagin 30%			160 mL