Tinción roja del nilo de C. elegans: Un método para visualizar las gotas lipídicas en animales fijos

Overview

Este video describe un protocolo para manchar lípidos en gusanos enteros y fijos usando tinte rojo del Nilo.  Para ver específicamente los lípidos neutros en el núcleo de las gotas lipídicas, imagine los espectros de emisión verde de los elegans C. manchados.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Escorcia et al, Cuantificación de la abundancia lipídica y evaluación de la distribución lipídica en Caenorhabditis elegans por Nilo Rojo y Aceite Rojo O Tinción, J. Vis. Exp. (2018).

1. Tinción de lípidos en rojo del nilo (NR)

1. Preparación de solución de stock NR de 5 mg/ml
   1. En una botella de 500 ml, añadir 100 mg de polvo NR a 200 ml de acetona 100%.
   2. Cubra la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.
   3. Antes de usarlo, revuelva la solución durante 2 h en la oscuridad.
   4. Para uso a largo plazo, almacene la solución de stock NR en una botella herméticamente sellada sin ninguna exposición a la luz. Solución de stock NR a escala según las necesidades de la investigación. Asegúrese de que la misma solución de stock se utiliza en experimentos de tinción de NR para obtener resultados consistentes de tinción e imágenes.
2. Preparación de la solución de trabajo NR
   1. Por cada 1 ml de isopropanol del 40% (v/v), agregue 6 μL de solución de stock NR.
   2. Prepare 600 μL de solución de trabajo NR para cada muestra.
      NOTA: Haga una solución de trabajo NR fresca justo antes de tinción. Dependiendo de las necesidades de solución de stock NR, utilice un tubo cónico graduado de 15 ml o 50 ml.
3. Preparación de gusanos para la tinción lipídica NR
   1. Cultivar gusanos a la etapa L4 temprana a 20 °C en semilla de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con OP50 E. colide registro tardío.
   2. Lave los gusanos de la placa con 1 ml de solución 1x salina amortiguada por fosfato + solución Tritón X-100 (PBST) tritón 0.01% y coloque la suspensión del gusano en un tubo de microfugio de 1,5 ml.
   3. Centrífuga los gusanos a 560 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante y repita este paso hasta que E. coli sea despejado de la suspensión.
   4. Añadir 100 μL de 40% de isopropanol al pellet de gusano e incubarlo a temperatura ambiente durante 3 min.
   5. Centrífuga los gusanos a 560 x g durante 1 min y retire el sobrenadante sin interrumpir el pellet de gusano.
      NOTA: Utilice volúmenes más altos de PBST para lavar los gusanos de las placas si utiliza placas más grandes o mancha más gusanos por placa. No lave los gusanos en PBST más de 15 minutos antes de la fijación de la muestra. Realice lavados adicionales si el sobrenadante no está libre de bacterias. Llevar a cabo la incubación en 40% isopropanol utilizando un nutator o balancín. Supervise siempre los tubos para asegurarse de que se está produciendo una agitación completa de la muestra.
4. Tinción lipídica con NR
   1. En la oscuridad, agregue 600 μL de solución de trabajo NR a cada muestra. Invierta los tubos tres veces y mezcle completamente los gusanos en la solución NR.
   2. Gire la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.
   3. Después de la incubación, centrífuga los gusanos a 560 x g durante 1 min y retire el sobrenadante.
   4. Añadir 600 μL de PBST e incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos para eliminar el exceso de mancha nr.
   5. Centrífuga las muestras a 560 x g durante 1 min y retire todas menos aproximadamente 50 μL de sobrenadante.
      NOTA: La incubación NR no requiere agitación. La sedimentación de gusanos es común durante este paso.
5. Preparación de diapositivas para imágenes de microscopio
   1. Resuspend el pellet de gusano en el sobrenadante restante.
   2. Coloque 5 μL de suspensión de gusano en una diapositiva del microscopio y coloque un control de cubierta cuidadosamente para evitar atrapar cualquier burbuja de aire.
   3. Selle el cubrebocas con esmalte de uñas antes de tomar imágenes de gusanos.
   4. Prepare sólo un par de diapositivas a la vez. Esto garantizará que las imágenes de NR permanezcan constantes en todas las muestras. La calidad de las imágenes manchadas de NR disminuye después de las 6 h. Las gotas lipídicas discretas son difíciles de observar y aumenta la fluorescencia de fondo, lo que interfiere con la detección de señal NR.
6. Imágenes de gusanos manchados de NR
   1. Imagine los gusanos a una ampliación de 5X para capturar varios animales por campo de visión.
   2. Cambie a una ampliación de 10X para una mejor cuantificación de gusanos individuales.
   3. Utilice el canal FITC/GFP para tomar imágenes de gusanos manchados de NR e intentar diferentes tiempos de exposición para determinar las condiciones óptimas para la cuantificación.
   4. Guarde archivos en formato TIF para evitar perder datos debido a la compresión.
      NOTA: Los tiempos de exposición típicos oscilan entre 100-1000 ms. Teniendo un tiempo de exposición óptimo, utilízalo para todas las muestras para mantener la consistencia de las imágenes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator