Nijlrode kleuring van C. elegans: een methode om lipidedruppels bij vaste dieren te visualiseren

Overview

Deze video beschrijft een protocol om lipiden in hele, vaste wormen te bevlekken met behulp van Nile Red-kleurstof.  Om specifiek de neutrale lipiden in de kern van lipidedruppels te bekijken, beeldt u de groene emissiespectra van de bevlekte C. elegans in.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nijlrood (NR) Kleuring van lipiden

1. Bereiding van 5 mg/ml NR-stamoplossing
   1. Voeg in een fles van 500 ml 100 mg NR-poeder toe aan 200 ml 100% aceton.
   2. Bedek de fles met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
   3. Roer de oplossing voor gebruik gedurende 2 uur in het donker.
   4. Bewaar de NR-voorraadoplossing voor langdurig gebruik in een goed afgesloten fles zonder enige blootstelling aan licht. Schaal nr voorraadoplossing volgens onderzoeksbehoeften. Zorg ervoor dat dezelfde stamoplossing wordt gebruikt bij NR-kleuringsexperimenten om consistente kleurings- en beeldvormingsresultaten te verkrijgen.
2. Voorbereiding van nr-werkoplossing
   1. Voeg voor elke 1 ml 40% isopropanol (v/v) 6 μL NR-stamoplossing toe.
   2. Bereid voor elk monster 600 μL NR-werkoplossing voor.
      OPMERKING: Maak een nieuwe NR-werkoplossing vlak voor het kleuren. Afhankelijk van de behoeften van de NR-voorraadoplossing, gebruikt u een 15 ml of 50 ml gegradueerde conische buis.
3. Bereiding van wormen voor NR lipidekleuring
   1. Laat wormen groeien tot het vroege L4-stadium bij 20 °C op nematodengroeimedium (NGM) gezaaid met laatstam OP50 E. coli.
   2. Was de wormen van de plaat met 1 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing + 0,01% Triton X-100 (PBST) oplossing en doe de wormsuspensie in een microfugebuis van 1,5 ml.
   3. Centrifugeer de wormen gedurende 1 min op 560 x g. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap totdat E. coli uit de suspensie is verwijderd.
   4. Voeg 100 μL 40% isopropanol toe aan de wormkorrel en incubeer deze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Centrifugeer de wormen gedurende 1 min op 560 x g en verwijder het supernatant zonder de wormkorrel te verstoren.
      OPMERKING: Gebruik hogere hoeveelheden PBST om de wormen van de platen te wassen als u grotere platen gebruikt of meer wormen per plaat kleurt. Was de wormen niet langer dan 15 minuten voor de monsterfixatie in PBST. Voer extra wasbeurten uit als het supernatant niet vrij is van bacteriën. Voer de incubatie uit in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker. Controleer altijd de buizen om er zeker van te zijn dat er volledige monsterroerding optreedt.
4. Lipidekleuring met NR
   1. Voeg in het donker 600 μL NR-werkoplossing toe aan elk monster. Draai de buizen drie keer om en meng de wormen volledig in NR-oplossing.
   2. Draai het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
   3. Centrifugeer de wormen na de incubatie gedurende 1 minuut op 560 x g en verwijder het supernatant.
   4. Voeg 600 μL PBST toe en incubeer de monsters gedurende 30 minuten in het donker om overtollige NR-vlekken te verwijderen.
   5. Centrifugeer de monsters gedurende 1 min op 560 x g en verwijder op ongeveer 50 μL supernatant na.
      OPMERKING: NR incubatie vereist geen agitatie. Bezinking van wormen komt vaak voor tijdens deze stap.
5. Voorbereiding van dia's voor microscoopbeeldvorming
   1. Resuspend de worm pellet in resterende supernatant.
   2. Plaats 5 μL wormsuspensie op een microscoopschuif en doe voorzichtig een afdeklip om te voorkomen dat er luchtbellen worden opgelopen.
   3. Sluit de hoeslip af met nagellak voordat u wormen in beeld brengen.
   4. Bereid slechts een paar dia's tegelijk voor. Dit zorgt ervoor dat NR-beeldvorming constant blijft tussen monsters. De kwaliteit van NR-bevlekte beelden neemt na 6 uur af. Discrete lipidedruppels zijn moeilijk waar te nemen en achtergrondfluorescentie neemt toe, wat de detectie van NR-signalen verstoort.
6. Beeldvorming van NR-bevlekte wormen
   1. Beeld de wormen op 5X vergroting om verschillende dieren per gezichtsveld vast te leggen.
   2. Schakel over naar 10X vergroting voor een betere kwantificering van individuele wormen.
   3. Gebruik het FITC/GFP-kanaal om NR-bevlekte wormen in beeld te krijgen en probeer verschillende belichtingstijden om de optimale omstandigheden voor kwantificering te bepalen.
   4. Sla bestanden op in TIF-indeling om te voorkomen dat gegevens verloren gaan als gevolg van compressie.
      OPMERKING: Typische belichtingstijden variëren van 100-1000 ms. Met een optimale belichtingstijd gebruikt u deze voor alle monsters om de consistentie van de beeldvorming te behouden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator