Manchas Vermelhas do Nilo de C. elegans: Um método para visualizar gotículas lipídicas em animais fixos

Overview

Este vídeo descreve um protocolo para manchar lipídios inteiros, vermes fixos usando corante Vermelho do Nilo.  Para visualizar especificamente os lipídios neutros no núcleo das gotículas lipídicas, imagem o espectro de emissão verde dos C. elegans manchados.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Escorcia et al, Quantificação da Abundância Lipídica e Avaliação da Distribuição Lipídica em Caenorhabditis elegans por Nilo Vermelho e Óleo Vermelho O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Manchas de lipídios

1. Preparação de solução de estoque NR de 5 mg/mL
   1. Em uma garrafa de 500 mL, adicione 100 mg de pó NR a 200 mL de acetona 100%.
   2. Cubra a garrafa com papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
   3. Antes de usar, mexa a solução por 2h no escuro.
   4. Para uso a longo prazo, armazene a solução de estoque NR em uma garrafa bem selada sem qualquer exposição à luz. Dimensione a solução de estoque NR de acordo com as necessidades da pesquisa. Certifique-se de que a mesma solução de estoque seja usada em experimentos de coloração de NR para obter resultados consistentes de coloração e imagem.
2. Preparação da solução de trabalho NR
   1. Para cada 1 mL de isopropanol de 40% (v/v), adicione 6 μL de solução de estoque NR.
   2. Prepare 600 μL de solução de trabalho NR para cada amostra.
      NOTA: Faça uma solução de trabalho nr fresco logo antes da coloração. Dependendo das necessidades de solução de estoque NR, use um tubo cônico graduado em 15 mL ou 50 mL.
3. Preparação de vermes para coloração lipídica NR
   1. Cresça os vermes até o estágio L4 inicial a 20 °C no meio de crescimento de nematoides (NGM) semeado com o atues de tronco tardio OP50 E. coli.
   2. Lave os vermes da placa com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de 1x + solução Triton X-100 (PBST) de 1x e coloque a suspensão do verme em um tubo de microfuça de 1,5 mL.
   3. Centrifugar os vermes a 560 x g por 1 min. Remova o supernatante e repita esta etapa até que E. coli seja liberado da suspensão.
   4. Adicione 100 μL de isopropanol de 40% à pelota de minhoca e incuba-a em temperatura ambiente por 3 minutos.
   5. Centrifugar os vermes a 560 x g por 1 min e remover o supernasce sem interromper a pelota de verme.
      NOTA: Use volumes mais altos de PBST para lavar os vermes das placas se usar placas maiores ou colorar mais vermes por placa. Não lave os vermes em PBST mais de 15 minutos antes da fixação da amostra. Realize lavagens adicionais se o supernaspe não for liberado de bactérias. Realizar a incubação em isopropanol de 40% usando um nutator ou roqueiro. Monitore sempre os tubos para garantir que a agitação completa da amostra esteja ocorrendo.
4. Mancha lipídica com NR
   1. No escuro, adicione 600 μL de solução de trabalho NR a cada amostra. Inverta os tubos três vezes e misture totalmente os vermes na solução NR.
   2. Gire a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
   3. Após a incubação, centrifugar os vermes a 560 x g por 1 min e remover o supernante.
   4. Adicione 600 μL de PBST e incubar as amostras no escuro por 30 minutos para remover o excesso de mancha NR.
   5. Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e remover todos, exceto aproximadamente 50 μL de supernasário.
      NOTA: A incubação nr não requer agitação. A fixação de vermes é comum durante esta etapa.
5. Preparação de slides para imagens de microscópio
   1. Resuspend a pelota de verme em remanescente supernante.
   2. Coloque 5 μL de suspensão de worm em um slide de microscópio e coloque uma mancha de cobertura cuidadosamente para evitar a captura de quaisquer bolhas de ar.
   3. Sele a mancha com esmalte antes de ver os vermes.
   4. Prepare apenas alguns slides de cada vez. Isso garantirá que as imagens NR permaneçam constantes em todas as amostras. A qualidade das imagens manchadas de NR diminui após 6 h. Gotículas lipídicas discretas são difíceis de observar e a fluorescência de fundo aumenta, o que interfere na detecção de sinal NR.
6. Imagem de vermes manchados de NR
   1. Imagem dos vermes na ampliação de 5X para capturar vários animais por campo de visão.
   2. Mude para ampliação de 10X para uma melhor quantificação de vermes individuais.
   3. Use o canal FITC/GFP para imaginar worms manchados de NR e tente diferentes tempos de exposição para determinar as condições ideais para quantificação.
   4. Salvar arquivos no formato TIF para evitar perder dados devido à compressão.
      NOTA: Os tempos típicos de exposição variam de 100-1000 ms. Tendo um tempo de exposição ideal, use-o para todas as amostras para manter a consistência da imagem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator