Nile Red Staining of C. elegans: Eine Methode zur Visualisierung von Lipidtröpfchen bei festen Tieren

Overview

Dieses Video beschreibt ein Protokoll, um Lipide in ganzen, festen Würmern mit Nile Red Farbstoff zu färben.  Um die neutralen Lipide im Kern von Lipidtröpfchen gezielt zu betrachten, stellen Sie sich die grünen Emissionsspektren der gefärbten C. elegans vor.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Escorcia et al, Quantifizierung der Lipid-Überfluss und Bewertung der Lipidverteilung in Caenorhabditis elegans von Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nilrot (NR) Färbung von Lipiden

1. Herstellung von 5 mg/ml NR Stofflösung
   1. In einer 500 ml Flasche 100 mg NR-Pulver zu 200 ml 100% Aceton hinzufügen.
   2. Bedecken Sie die Flasche mit Aluminiumfolie, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
   3. Vor Gebrauch die Lösung für 2 h im Dunkeln rühren.
   4. Für den langfristigen Einsatz lagern Sie die NR-Lagerlösung in einer dicht verschlossenen Flasche ohne Lichteinwirkung. Skalieren Sie die NR-Lagerlösung entsprechend den Forschungsanforderungen. Stellen Sie sicher, dass die gleiche Stofflösung in NR-Färbungsexperimenten verwendet wird, um konsistente Färbe- und Bildgebungsergebnisse zu erzielen.
2. Vorbereitung der NR-Arbeitslösung
   1. Geben Sie für jede 1 ml 40% Isopropanol (v/v) 6 l NR-Lagerlösung hinzu.
   2. Bereiten Sie für jede Probe 600 L NR-Arbeitslösung vor.
      HINWEIS: Machen Sie frische NR-Arbeitslösung direkt vor der Färbung. Je nach Bedarf an NR-Lagerlösung verwenden Sie entweder ein 15 ml oder 50 ml abgestuftes konisches Rohr.
3. Zubereitung von Würmern für DIE NR-Lipidfärbung
   1. Wachsen Sie Würmer bis zum frühen L4-Stadium bei 20 °C auf Nematodenwachstumsmedium (NGM) mit spätem Log OP50 E. coligesät.
   2. Waschen Sie die Würmer mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochung + 0,01% Triton X-100 (PBST) Lösung von der Platte und legen Sie die Schneckensuspension in ein 1,5 ml Mikrofugenrohr.
   3. Zentrifugieren Sie die Würmer bei 560 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis E. coli von der Suspension befreit ist.
   4. Fügen Sie dem Wurmpellet 100 l 40 % Isopropanol hinzu und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 3 min.
   5. Zentrifugieren Sie die Würmer bei 560 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu stören.
      HINWEIS: Verwenden Sie höhere Mengen an PBST, um die Würmer von den Platten zu waschen, wenn Sie größere Platten verwenden oder mehr Würmer pro Platte färben. Waschen Sie die Würmer in PBST nicht mehr als 15 min vor der Probenfixierung. Führen Sie zusätzliche Wäranstriche durch, wenn der Überstand nicht von Bakterien befreit ist. Führen Sie die Inkubation in 40% Isopropanol mit einem Nutator oder Rocker. Überwachen Sie die Rohre immer, um sicherzustellen, dass eine vollständige Probenrührung auftritt.
4. Lipidfärbung mit NR
   1. Fügen Sie im Dunkeln jeder Probe 600 L NR-Arbeitslösung hinzu. Dreimal die Rohre inumkehren und die Würmer in DER NR-Lösung vollständig mischen.
   2. Drehen Sie die Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 2 h.
   3. Zentrifugieren Sie die Würmer nach der Inkubation 1 min bei 560 x g und entfernen Sie den Überstand.
   4. Fügen Sie 600 l PBST hinzu und inkubieren Sie die Proben im Dunkeln für 30 min, um überschüssige nN-Färbung zu entfernen.
   5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 560 x g für 1 min und entfernen Sie alle bis auf ca. 50 l Überstand.
      HINWEIS: Die INkubation von NR erfordert keine Agitation. Die Setzung von Würmern ist in diesem Schritt üblich.
5. Vorbereitung von Dias für die Mikroskop-Bildgebung
   1. Setzen Sie das Wurmpellet im verbleibenden Überstand wieder auf.
   2. Legen Sie 5 l Schneckensuspension auf ein Mikroskopschlitten und legen Sie einen Deckelschlupf vorsichtig auf, um Luftblasen nicht einzufangen.
   3. Versiegeln Sie den Coverslip mit Nagellack, bevor Sie Würmer bildgeben.
   4. Bereiten Sie nur ein paar Folien gleichzeitig vor. Dadurch wird sichergestellt, dass die NR-Bildgebung über die Proben hinweg konstant bleibt. Die Qualität der NR-gefärbten Bilder nimmt nach 6 h ab. Diskrete Lipidtröpfchen sind schwer zu beobachten und die Hintergrundfluoreszenz nimmt zu, was die NR-Signalerkennung stört.
6. Abbildung von NR-befleckten Würmern
   1. Stellen Sie die Würmer mit der 5-fachen Vergrößerung auf, um mehrere Tiere pro Sichtfeld zu erfassen.
   2. Wechseln Sie zur 10-fachen Vergrößerung, um die einzelnen Würmer besser zu quantifizieren.
   3. Verwenden Sie den FITC/GFP-Kanal, um NR-gefleckte Würmer abzubilden und verschiedene Belichtungszeiten auszuprobieren, um die optimalen Bedingungen für die Quantifizierung zu bestimmen.
   4. Speichern Sie Dateien im TIF-Format, um Datenverluste aufgrund der Komprimierung zu vermeiden.
      HINWEIS: Typische Belichtungszeiten liegen zwischen 100 und 1000 ms. Mit einer optimalen Belichtungszeit verwenden Sie es für alle Proben, um die Bildkonsistenz aufrechtzuerhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator