C. 예르건의나일 레드 스테인링 : 고정 동물의 지질 방울을 시각화하는 방법

Overview

이 비디오는 나일 레드 염료를 사용하여 전체, 고정 웜에 지질을 얼룩 프로토콜을 설명합니다.  지질 방울의 코어에서 중립 지질을 구체적으로 보려면 염색 된 C. elegans의 녹색 방출 스펙트럼을 이미지하십시오.

Protocol

이 프로토콜은 에스코르시아 외에서발췌, 지질 풍부의 정량화 및 나일 레드 와 오일 레드 O 스테닝에 의해 Caenorhabditis elegans에서 지질 분포의 평가, J. Vis. Exp. (2018).

1. 나일 레드 (NR) 지질의 염색

1. 5 mg /mL NR 재고 솔루션의 준비
   1. 500mL 병에 100 mg의 NR 파우더를 100% 아세톤200mL에 넣습니다.
   2. 알루미늄 호일로 병을 덮어 빛에 노출되지 않도록 하십시오.
   3. 사용하기 전에 어둠 속에서 2 시간 동안 용액을 저어줍니다.
   4. 장기간 사용시 NR 스톡 솔루션을 단단히 밀봉한 병에 빛 노출 없이 보관하십시오. 연구 요구에 따라 NR 주식 솔루션을 확장합니다. 일관된 염색 및 이미징 결과를 얻기 위해 NR 염색 실험에서 동일한 스톡 솔루션을 사용하도록 합니다.
2. NR 작업 솔루션 준비
   1. 40% 이소프로판올(v/v)의 1mL마다 NR 스톡 솔루션 6μL을 추가합니다.
   2. 각 샘플에 대해 NR 작업 솔루션 600 μL을 준비합니다.
      참고: 염색 하기 직전에 신선한 NR 작업 솔루션을 확인 합니다. NR 스톡 솔루션 요구에 따라 15mL 또는 50mL 졸업 원콘 튜브를 사용하십시오.
3. NR 지질 염색을위한 벌레의 준비
   1. 늦은 로그 OP50 E. 대장균으로시드된 선충 성장 배지(NGM)에 20°C에서 초기 L4 단계로 웜을 성장시한다.
   2. 1x 인산염 완충식식염 +0.01% 트리톤 X-100(PBST) 용액의 1mL로 플레이트에서 웜을 세척하고 웜 서스펜션을 1.5mL 마이크로퍼지 튜브에 넣습니다.
   3. 1 분 동안 560 x g에서 벌레를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 대장균이 서스펜션에서 지워질 때까지 이 단계를 반복하십시오.
   4. 벌레 펠릿에 40% 이소프로판올100 μL을 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
   5. 1 분 동안 560 x g에서 벌레를 원심 분리하고 벌레 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 제거합니다.
      참고: 더 많은 양의 PBST를 사용하여 더 큰 플레이트를 사용하거나 플레이트당 더 많은 벌레를 염색하는 경우 웜을 플레이트에서 씻어냅니다. 샘플 고정 하기 전에 15 분 이상 PBST에서 웜을 세척 하지 마십시오. 상체가 박테리아를 지워지지 않으면 추가 세서를 수행하십시오. 영양사 나 로커를 사용하여 40 % 이소 프로파놀에서 인큐베이션을 수행하십시오. 항상 튜브를 모니터링하여 전체 샘플 교반이 발생하는지 확인합니다.
4. NR과 지질 염색
   1. 어둠 속에서 각 샘플에 NR 작업 용액 600 μL을 추가합니다. 튜브를 세 번 반전하고 NR 용액의 웜을 완전히 혼합합니다.
   2. 실온에서 2시간 동안 어둠 속에서 샘플을 회전시.
   3. 인큐베이션에 따라 웜을 560 x g에서 1분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다.
   4. PBST의 600 μL을 추가하고 과도한 NR 얼룩을 제거하기 위해 30 분 동안 어둠 속에서 샘플을 배양합니다.
   5. 원심 분리는 샘플을 560 x g에서 1 분 동안 제거하고 약 50 μL의 상류체를 제외한 모든 것을 제거합니다.
      참고: NR 잠복기는 교반이 필요하지 않습니다. 이 단계에서 벌레의 침전은 일반적입니다.
5. 현미경 이미징용 슬라이드 준비
   1. 남은 상수에서 벌레 펠릿을 다시 중단합니다.
   2. 현미경 슬라이드에 벌레 서스펜션 5 μL을 놓고 기포를 포획하지 않도록 조심스럽게 커버슬립을 놓습니다.
   3. 이미징 웜 전에 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
   4. 한 번에 몇 개의 슬라이드만 준비합니다. 이렇게 하면 NR 이미징이 샘플 전반에 걸쳐 일정하게 유지됩니다. NR 염색 된 이미지의 품질은 6 시간 후에 감소합니다. 이산 지질 물방울은 관찰하기 어렵고 배경 형광이 증가하여 NR 신호 감지를 방해합니다.
6. NR 염색 된 벌레의 이미징
   1. 5배 배율로 웜을 이미지하여 시야당 여러 동물을 포획합니다.
   2. 개별 웜의 더 나은 정량화를 위해 10배 배율로 전환합니다.
   3. FITC/GFP 채널을 사용하여 NR 염색 된 웜을 이미지화하고 다른 노출 시간을 시도하여 정량화에 대한 최적의 조건을 결정하십시오.
   4. 압축으로 인해 데이터가 손실되지 않도록 TIF 형식으로 파일을 저장합니다.
      참고: 일반적인 노출 시간은 100-1000 ms에서 구역 수색됩니다. 최적의 노출 시간을 갖는 모든 샘플에 사용하여 이미징 일관성을 유지합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator