C. 근육 영역 측정: 규기 된 근육 형태를 정량화 하는 표준화 된 방법

Overview

C. 엘레간은 근육의 두 가지 유형을 가지고, 단일 사코메르와 여러 sarcomere, 또는 스트라이드 근육.  이 비디오는웜의운동을 담당하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 근육 형태를 측정하는 샘플 프로토콜을 포함하는 줄무늬 바디 월 근육의 배열을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Teoh 외에서 발췌, 케노르 하비티스 엘레건의세포 구조 와 세포 구세포 형태학을 연구하기위한 정량적 접근, J. Vis. Exp. (2019). 

1. 체벽 근육 구조를 정량화

1. 바디 벽 근육 구조의 형광화상 진찰 
   1. GFP로 미오신 섬유를 라벨을 부착하는 트랜스진 stEx30(Pmyo-3:gfp::myo-3 + rol-6(su1006)을 운반하는 균주(예를 들어, RW1596)를획득한다.
      참고: 동물로 의 전환유전자의 도입은 이미 트랜스진을 표현하는 동물과 관심의 변형을 교차하거나, 고나드의 탈면 팔에 DNA를 마이크로 주입함으로써 달성 될 수있다. 이 트랜스진에서 rol-6 돌연변이에 의해 유도된 '롤링' 표현형은 근육의 시각화를 용이하게 한다. 바디 월 근육은 일반적으로 그들의 측면 의 한에 거짓말을 하기 때문에 야생 형 동물의 보기에서 일반적으로 배제되는 등쪽과 복부 측면을 따라 실행됩니다. rol-6 (su1006) 알렐은 동물의 비틀림을 유도하여 이미징을 위해 일부 근육 세포를 노출시합니다.
   2. 고해상도 충전 결합 장치 카메라(CCD), 40X 목표 이상, GFP 필터 및 획득 소프트웨어와 결합된 형광 현미경을 사용하여 동물을 이미지합니다.
   3. 노출 시간과 조명 강도를 조정하여 과포화 된 이미지를 방지합니다.
   4. 적어도 하나의 완전한 눈에 보이는 경사 근육 세포를 포함하는 동물의 섹션에서 근육 (400X 배율)의 이미지를 캡처하고 저장합니다. 불완전한 단일 근육 세포 또는 초점이 없는 단면도를 가진 지구를 피하십시오. 또한 극단적인 전방 및 후방 영역 및 외음부에 인접한 영역에서 이미지를 제외합니다.
      참고: 동물이 눈에 잘 띄는 완전한 근육 세포가 없는 경우 커버슬립을 부드럽게 밀어 동물을 돌려 완전한 세포를 노출시합니다.
2. 근육 세포 영역 의 측정
   1. 피지 소프트웨어에서 이미지를 엽니 다 (버전 2.0.0이 연구에서 사용되었다).
   2. 다각형 선택을 사용하여 단일 경사 근육 세포를 조심스럽게 추적하십시오. 트레이싱을 개선하기 위해 앵커 점을 드래그하여 끝에 다각형의 선을 조정합니다.
   3. 소프트웨어 상단의 탭 분석으로 이동하여 측정값을 클릭하여 선택 영역을 계산합니다. 영역 및 기타 측정값이 포함된 별도의 결과 테이블이 표시됩니다. 결과 테이블에서 영역 측정값이 누락된 경우 분석 탭 아래에측정 설정으로이동하여 영역 상자가 체크인되었는지 확인합니다. 마찬가지로 필요하지 않은 다른 측정을 선택 해제합니다. 
   4. 분해/누락된 영역이 있는 근육 세포의 경우 다각형 선택 도구를 사용하여 누락된 영역을 추적하고 측정을 다시 클릭합니다. 셀 내에 간격이 여러 개 있는 경우 각 간격을 별도로 추적합니다.
   5. 전체 단일 근육 세포에 대한 갭 영역의 비율을 계산합니다. 높은 비율은 세포 내의 큰 간격 때문에 근육 변성의 더 높은 범위를 나타냅니다. 야생 동물에서 흔하 듯이 누락된 지역이 없는 경우 비율은 0으로 계산됩니다.
      참고: 대조군으로서, 또한 근육 구조 결함에 대한 점수는 시각적으로 결과를 정량적 측정과 비교한다. 이것은 균주가 실험실에서 처음으로 연구되는 경우에 특히 유용합니다. 표현력 있는 점수의 경우, 필라멘트의 무결성에 따라 결함이 있거나 결함이 없는 동물로 동물을 평가합니다. 예를 들면, 구조 적인 고장 때문에 뚜렷한 필라멘트 줄무늬, GFP 응집, 또는 근육 세포 내의 간격의 손실을 가진 동물은, 불완전한 것으로 득점될 것입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40