Зебрафиш Реотаксис Анализ: Метод измерения ориентации поведения в ответ на различные скорости потока воды

Overview

Это видео описывает анализ реотаксиса у зебры. Метод предполагает измерение ориентации поведения зебры в ответ на различные темпы потока воды под воздействием различных магнитных полей.

Protocol

1.Настройка магнитного поля с одномерным магнитным полем манипуляции

1. Включите силовой агрегат(рисунок 1A).
2. Поместите спиральный туннель в место, где будет выполняться реотаксический протокол (раздел 3), но держите его отключенным от плавательного аппарата(рисунок 1A). Поместите магнитный зонд, подключенный к Гауссу/Тесламетру, внутри туннеля и проясните, какое напряжение необходимо для получения выбранного значения магнитного поля вдоль основной оси туннеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за магнитных свойств соленоида, поле достаточно равномерно внутри туннеля; это можно проверить, медленно перемещая зонд как горизонтально, так и вертикально.
3. Отключите зонд и соедините туннель потока с плавательный аппарат.
4. Начните с реотаксического протокола (раздел 3).

2. Настройка магнитного поля с трехмерным магнитным полем манипуляции

1. Включите драйверы процессора, DAC и катушки(рисунок 1B).
2. Установите выбранное магнитное поле на каждый из трех осей (x, y и z).
3. Поместите туннель в центр набора пар Гельмгольца.
4. Начните с реотаксического протокола (раздел 3).

3. Испытание Зебрафиш Реотаксис в камере потока

1. Перенесите одну-пять рыб в туннель потока с помощью резервуара 2 л со сторонами и дном.
2. Включите насос и установите скорость потока в туннеле до 1,7 см/с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта медленно движущаяся вода будет держать воду в туннеле кислородом, и это облегчит восстановление животных.
3. Пусть животные акклиматизируются к плавательному туннелю на 1 ч.
4. Запустите видеозапись поведения рыбы в туннеле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали камеру (например, Yi 4K Action) с пультом дистанционного управления (например, Bluetooth) и сохранили видео как .mpg (30 кадров/с).
5. Начать шаг за шагом увеличение скорости потока в соответствии с выбранным экспериментальным протоколом (1,3 см/с в данном исследовании; Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола мы использовали низкие скорости потока, которые, для зебры, варьируются от 0 до 2,8 BL (длина тела)/с. Эти скорости потока находятся в нижнем диапазоне скорости потока, которые вызывают непрерывное ориентированное плавание в зебрафиш (3%-15% от критической скорости плавания (U_crit). Использование низких скоростей потока (в соответствии с протоколом Бретта) связано с специфическими поведенческими характеристиками этого вида в присутствии водных течений. Зебрафиш, как правило, плавают вдоль главной оси камеры, часто поворачивая, даже при наличии потока воды, и, как правило, плавают как вверх по течению, так и вниз по течению. На такое поведение влияет скорость потока воды, исчезающающая на относительно высоких скоростях (8 BL/s), когда животные непрерывно плавают лицом вверх по течению (полная положительная реотаксическая реакция). Вертикальные и поперечные перемещения встречаются очень редко.
6. Выполняйте морфометрию животных (пол и общая длина ,TL), длина вилки (FL) или BL) на снимках рыб в морфометрической камере.
   1. Выберите соответствующую картинку.
   2. Откройте картинку в ImageJ.
   3. Принять к сведению пол животного (мужчины зебры стройные и, как правило, желтоватые, в то время как женщины более округлые и, как правило, имеют синие и белые окраски).
   4. Нажмите «Проанализируйте» и установите шкалу изображения в сантиметрах, используя в качестве эталона всю горизонтальную длину туннеля.
   5. Нажмите Анализируйте и заместите и завестите линейную длину животного.
   6. Рассчитайте его вес тела (BW).
      ПРИМЕЧАНИЕ: BW рассчитывается на основе отношений между sex-FL-BW, ранее построенных в лаборатории, или метаданных. Вся процедура позволяет избежать манипуляции нагрузкой на животных.

Representative Results

Рисунок 1: Настройка для управления магнитным полем. (A) Рендеринг плавательного туннеля с соленоидом для индукции статического, горизонтального магнитного поля в туннеле. Соленоид (0,83 оборота/см) соединен с силовым агрегатом и генерирует поля в диапазоне ±250 мкт (диапазон интенсивности, который включает диапазон магнитного поля Земли). С правой стороны показана фотография соленоидного туннеля, подключенного к плавательному аппарату. Туннель изготовлен из акрила и имеет две перфорированные акриловые пластины, размещенные на входе воды, которые гарантируют, что поток будет близко к ламинару. (B)Диаграмма и фото трех пар ортогональных гельмгольца, установленных для управления магнитным полем в геомагнитном диапазоне интенсивности. Также показаны зонд магнитного поля, процессор, цифровой аналоговый преобразователь и драйверы катушки, используемые для закрытия петли. Каждая пара катушек состоит из двух круговых катушек с радиусом(г)30 см и N 50 поворотов медных проводов AWG-14. Трех осей магнитометр (сенсор) с выбираемой шкалой (± 88 мкт до ± 810 мкт) расположен близко к центру катушки набора. Диапазон датчиков установлен на значения, начиная от ±130 кТ. Эти значения также использовались для измерений, описанных в репрезентативных результатах (в этих условиях номинальное разрешение датчика составляет около 0,1 МКТ). Интенсивность и направление магнитного поля контролируются с помощью цифровой системы обратной связи. Датчик измеряет три компонента вектора магнитного поля (три оси), и соответствующие сигналы ошибки извлекаются. Затем сигналы коррекции генерируются простым фильтром интегратора. Сигналы цифровой коррекции преобразуются в напряжение с помощью цифрового к аналоговому преобразователь и усиливаются подходящим драйвером катушки. Эти последние сигналы используются для привода пар Гельмгольца. Частота выборки фиксируется до 5 Гц, а частота усиления единства петель составляет около 0,16 Гц. После того, как токи в парах Гельмгольца катушки установлены, общее магнитное поле колеблется менее чем на 2% от его среднего значения интенсивности в центральном кубическом объеме (с краем (L ) 10 см) катушек. Во время измерений, магнитное поле rms составляет менее 0,2 qT. В обеих установках (панели A и B) статическое электрическое поле генерируется током в катушках, производящих магнитное поле. Интенсивность электрического поля составляет около 0,4 В/м при применении максимального тока; это значение является незначительным по сравнению с естественными или искусственными статичными полями, присутствующими в окружающей среде, интенсивность которых составляет порядка 1 кВ/м.

Рисунок 2: Диаграмма скорость потока, используемая во время испытаний для определения реотаксического порога зебры. Потока в течение 1 ч акклиматизации было достаточно, чтобы гарантировать адекватное снабжение животных кислородом. Можно предположить, что при такой конструкции, подача кислорода никогда не является пределом, даже в первые 10 минут шаг с потоком 0. Действительно, при содержании кислорода в воде в 27 градусов по Цельсию около 7,9 мг/л и потреблении кислорода животными 1 мг/ч (избыточное приближение к потреблению кислорода зебры как в обычных условиях, так и при низкой скорости плавания), можно подсчитать, что, при отсутствии потока, Po_{2 в} flume не уменьшится более чем на 2% на животное, оставаясь значительно выше критического Po₂ (около 40 торр для зебры).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat