Ensaio de Reotaxis de Zebrafish: Um método para medir o comportamento de orientação em resposta às diferentes taxas de fluxo de água

Overview

Este vídeo descreve o ensaio de reotaxis em zebrafish. O método envolve a medição do comportamento de orientação dos zebrafish em resposta a diferentes taxas de fluxo de água sob a influência de diferentes campos magnéticos.

Protocol

1.Configuração do Campo Magnético com a Manipulação de Campo Magnético Unidimensional

1. Ligue a unidade de alimentação(Figura 1A).
2. Coloque o túnel enrolado no local onde o protocolo reotactico será realizado (seção 3), mas mantenha-o desconectado do aparelho de natação(Figura 1A). Coloque uma sonda magnética conectada com um Gauss/Teslameter dentro do túnel e verifique qual tensão é necessária para obter o valor do campo magnético escolhido ao longo do eixo principal do túnel.
   NOTA: Devido às propriedades magnéticas de um solenoide, o campo é razoavelmente uniforme dentro do túnel; isso pode ser verificado movendo lentamente a sonda horizontal e verticalmente.
3. Desconecte a sonda e conecte o túnel de fluxo ao aparelho de natação.
4. Comece com o protocolo reotactico (seção 3).

2. Configuração do Campo Magnético com a Manipulação do Campo Magnético Tridimensional

1. Ligue os drivers cpu, DAC e bobina(Figura 1B).
2. Defina o campo magnético escolhido em cada um dos três eixos (x, y e z).
3. Coloque o túnel no centro do conjunto de pares Helmholtz.
4. Comece com o protocolo reotactico (seção 3).

3. Teste do Peixe-Zebra Rheotaxis na Câmara de Fluxo

1. Transfira de um a cinco peixes para o túnel de fluxo usando um tanque 2 L com as laterais e o fundo obscurecido.
2. Ligue a bomba e coloque a vazão no túnel para 1,7 cm/s.
   NOTA: Esta água em movimento lento manterá a água no túnel oxigenada e facilitará a recuperação animal.
3. Deixe os animais se aclimatarem ao túnel de natação por 1h.
4. Inicie a gravação de vídeo do comportamento do peixe no túnel.
   NOTA: Usamos uma câmera (por exemplo, Yi 4K Action) com controle remoto (por exemplo, Bluetooth) e salvamos o vídeo como .mpg (30 quadros/s).
5. Inicie o aumento stepwise da taxa de fluxo de acordo com o protocolo experimental escolhido (1,3 cm/s neste estudo; Figura 2).
   NOTA: Para este protocolo, utilizamos baixas taxas de fluxo que, para zebrafish, variam de 0 a 2,8 BL (comprimentos do corpo)/s. Essas velocidades de fluxo estão na faixa mais baixa de taxas de fluxo que induzem a natação contínua orientada em zebrafish (3%-15% de velocidade crítica de natação [U_crit]). O uso de baixas taxas de fluxo (seguindo o protocolo de Brett) está ligado às características comportamentais específicas desta espécie na presença de correntes de água. Os zebrafish tendem a nadar ao longo do eixo principal da câmara, girando com frequência, mesmo na presença de fluxo de água, e tendem a nadar tanto rio acima quanto rio abaixo. Esse comportamento é afetado pela taxa de fluxo de água, desaparecendo em velocidades relativamente altas (>8 BL/s), quando os animais nadam continuamente de frente para cima (resposta reotactica totalmente positiva). Deslocamentos verticais e transversais são muito raros.
6. Realizar morfometria dos animais (sexo e comprimento total [TL], comprimento do garfo [FL], ou BL) em imagens de peixes em uma câmara morfométrica.
   1. Selecione a imagem apropriada.
   2. Abra a imagem no ImageJ.
   3. Tome nota do sexo do animal (os zebrafish machos são esbeltos e tendem a ser amarelados, enquanto as fêmeas são mais arredondadas e tendem a ter corantes azuis e brancos).
   4. Clique em Analisar > Definir escala e definir a escala da imagem em centímetros, usando todo o comprimento horizontal do túnel como referência.
   5. Clique em Analisar > Medir e registrar o comprimento linear do animal.
   6. Calcule seu peso corporal (BW).
      NOTA: BW é calculado a partir de relações sexo-FL-BW anteriormente construídas no laboratório ou a partir de metadados. Todo o procedimento evita o estresse de manipulação nos animais.

Representative Results

Figura 1: Configuração para controle de campo magnético. (A) Renderização do túnel de natação com um solenoide para a indução de um campo magnético estático e horizontal dentro do túnel. O solenoide (0,83 voltas/cm) está conectado a uma unidade de potência e gera campos na faixa de ±250 μT (alcance de intensidade que inclui a faixa de campo magnético da Terra). Do lado direito, uma foto do túnel solenoide conectado ao aparelho de natação é mostrada. O túnel é feito de acrílico e tem duas placas de acrílico perfuradas colocadas na entrada de água, que garantem que o fluxo fique próximo ao laminar. (B) Diagrama e foto dos três pares ortogonais helmholtz definidos para o controle do campo magnético na faixa geomagnética de intensidades. A sonda de campo magnético, a CPU, o conversor digital-analógico e os drivers de bobina usados para fechar o loop também são mostrados. Cada par de bobinas é composto de duas bobinas circulares com um raio(r)de 30 cm e N = 50 voltas de fios de cobre AWG-14. Um magnetômetro de três eixos (sensor) com escala selecionável (± 88 μT a ± 810 μT) é colocado perto do centro do conjunto de bobinas. A gama de sensores é definida como valores que variam a ±130 μT. Esses valores também foram utilizados para as medições descritas nos resultados representativos (nestas condições, a resolução do sensor nominal é de cerca de 0,1 μT). A intensidade e a direção do campo magnético são controladas com um sistema de feedback digital. O sensor mede os três componentes do vetor de campo magnético (os três eixos), e os sinais de erro correspondentes são extraídos. Em seguida, os sinais de correção são gerados por um simples filtro integrador. Os sinais de correção digital são convertidos em tensão por um conversor digital-analógico e amplificados por um driver de bobina adequado. Estes últimos sinais são usados para conduzir os pares Helmholtz. A frequência amostral é fixada em 5 Hz e a frequência de ganho de unidade dos loops é de cerca de 0,16 Hz. Uma vez que as correntes nos pares Helmholtz das bobinas são definidas, o campo magnético total varia menos de 2% de seu valor médio de intensidade no volume cúbico central (com borda [L] = 10 cm) das bobinas. Durante as medições, o campo magnético rms é inferior a 0,2 μT. Em ambas as configurações (painéis A e B) um campo elétrico estático é gerado pela corrente nas bobinas que produzem o campo magnético. A intensidade do campo elétrico é de cerca de 0,4 V/m quando a corrente máxima é aplicada; este valor é insignificante em comparação com campos estáticos naturais ou artificiais presentes no ambiente cuja intensidade é da ordem de 1 kV/m.

Figura 2: Diagrama das taxas de fluxo utilizadas durante os testes para determinar o limiar reotactico do zebrafish. O fluxo durante o período de aclimatação de 1 h foi suficiente para garantir um fornecimento adequado de oxigênio aos animais. Pode-se supor que, com este design, o fornecimento de oxigênio nunca é um limite, mesmo no primeiro passo de 10 minutos com fluxo 0. De fato, com um teor de oxigênio de água a 27 °C de cerca de 7,9 mg/L e um consumo de oxigênio animal de 1 mg/h.g (uma aproximação excessiva para o consumo de oxigênio de zebrafish tanto em condições rotineiras quanto em natação de baixa velocidade), é possível calcular que, na ausência de fluxo, o Po₂ no flume não diminuirá mais de 2% por animal, permanecendo bem acima do Po₂ crítico (cerca de 40 torr para zebrafish).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat