זברהפיש ריוטקסיס אסאי: שיטה למדידת התנהגות אוריינטציה בתגובה לקצבי זרימת מים שונים

Overview

סרטון זה מתאר את מבחני הראוטקסיס בדגי זברה. השיטה כוללת מדידת התנהגות אוריינטציה של דגי זברה בתגובה לקצבי זרימת מים שונים בהשפעת שדות מגנטיים שונים.

Protocol

1.הגדרת השדה המגנטי עם מניפולציה חד מימדית של השדה המגנטי

1. הפעל את יחידת הכוח (איור 1A).
2. הניחו את המנהרה המפותלה במקום שבו יבוצע הפרוטוקול הריאקטי (סעיף 3) אך שמרו אותה מנותקת ממנגנוןהשחייה (איור 1A). הנח בדיקה מגנטית המחוברת עם גאוס / טסלמטר בתוך המנהרה וודא איזה מתח נחוץ כדי להשיג את ערך השדה המגנטי שנבחר לאורך הציר הראשי של המנהרה.
   שים לב: בגלל התכונות המגנטיות של סולנואיד, השדה אחיד למדי בתוך המנהרה; ניתן לבדוק זאת על-ידי הזזה איטית של הגשוש הן אופקית והן אנכית.
3. נתק את הגשוש וחבר את מנהרת הזרימה למנגנון השחייה.
4. התחל עם הפרוטוקול הריאקטי (סעיף 3).

2. הגדרת השדה המגנטי עם מניפולציה תלת מימדית של השדה המגנטי

1. הפעל את מנהלי ההתקנים של המעבד המרכזי, ה- DAC והסליל (איור 1B).
2. הגדר את השדה המגנטי הנבחר על כל אחד משלושת הצירים (x, y ו- z).
3. מניחים את המנהרה במרכז סט הזוגות הלמהולץ.
4. התחל עם הפרוטוקול הריאקטי (סעיף 3).

3. מבחן של Rheotaxis דג זברה בתא זרימה

1. מעבירים דג אחד עד חמישה למנהרת הזרימה באמצעות מיכל 2 L עם הצדדים והתחתית מוסתרת.
2. הפעילו את המשאבה והגדירו את קצב הזרימה במנהרה ל-1.7 ס"מ/ים.
   שים לב: מים איטיים אלה ישאירו את המים במנהרה מחומצנים וזה יקל על התאוששות בעלי החיים.
3. תן לבעלי החיים להתאקלם למנהרת השחייה במשך שעה.
4. התחל את הקלטת הווידאו של התנהגות הדגים במנהרה.
   שים לב: השתמשנו במצלמה (למשל, Yi 4K Action) עם שלט רחוק (למשל, Bluetooth) ושמרנו את הווידאו .mpg (30 פריימים/ים).
5. התחל את העלייה החורגת של קצב הזרימה על פי פרוטוקול הניסוי שנבחר (1.3 ס"מ / ים במחקר זה; איור 2).
   שים לב: עבור פרוטוקול זה, השתמשנו בקצבי זרימה נמוכים אשר, עבור zebrafish, נע בין 0 ל 2.8 BL (אורך הגוף)/s. מהירויות זרימה אלה נמצאות בטווח הנמוך יותר של קצבי זרימה שגורמים לשחייה רציפה בדג זברה (3%-15% ממהירות השחייה_{הקריטית [U crit]).} השימוש בשיעורי זרימה נמוכים (בהתאם לפרוטוקול של ברט) קשור למאפיינים ההתנהגותיים הספציפיים של מין זה בנוכחות זרמי מים. דגי זברה נוטים לשחות לאורך הציר הראשי של התא, פונים לעתים קרובות, אפילו בנוכחות זרימת מים, ונוטים לשחות הן במעלה הזרם והן במורד הזרם. התנהגות זו מושפעת מקצב זרימת המים, ונעלמת במהירויות גבוהות יחסית (>8 BL/s), כאשר בעלי החיים שוחים ללא הרף עם הפנים במעלה הזרם (תגובה ריאקטית חיובית מלאה). תזוזות אנכיות וחוצות הן נדירות מאוד.
6. בצעו מורפומריה של בעלי החיים (מין ואורך כולל [TL], אורך מזלג [FL] או BL) על תמונות של דגים בתא מורפומטרי.
   1. בחר את התמונה המתאימה.
   2. פתח את התמונה ב- ImageJ.
   3. שימו לב למין החיה (דגי זברה זכרים דקים ונוטים להיות צהבהבים, בעוד שהנקבות מעוגלים יותר ונוטות לצבעים כחולים ולבנים).
   4. לחץ על נתח > קבע קנה מידה והגדר את קנה המידה של התמונה בסנטימטרים, תוך שימוש בכל האורך האופקי של המנהרה כהפניה.
   5. לחץ על נתח > מדידה והקלט את האורך הליניארי של החיה.
   6. לחשב את משקל גופו (BW).
      שים לב: BW מחושב ממערכות יחסים סקס-FL-BW שנבנו בעבר במעבדה או מטה-נתונים. ההליך כולו מונע לחץ מניפולציה על בעלי החיים.

Representative Results

איור 1: התקנה לבקרת שדה מגנטי. (A) עיבוד מנהרת השחייה עם סולנואיד לאיחוי של שדה מגנטי סטטי ואופקי בתוך המנהרה. הסולנואיד (0.83 סיבובים/ס"מ) מחובר ליחידת כוח והוא מייצר שדות בטווח של ±250 מיקרוט (טווח עוצמה הכולל את טווח השדה המגנטי של כדור הארץ). בצד ימין, מוצגת תמונה של מנהרת הסולנואיד המחוברת למנגנון השחייה. המנהרה עשויה אקריליק ויש לה שתי לוחות אקריליק מחוררים הממוקמים במפרצון המים, המבטיחים שהזרימה תהיה קרובה ללמינאר. (B) דיאגרמה ותמונה של שלושת זוגות הלמהולץ האורתוגונליים שנקבעו לשליטה בשדה המגנטי בטווח העוצמות הגיאומגנטי. גשוש השדה המגנטי, המעבד, הממיר הדיגיטלי-לאנלוגי ומנהלי ההתקנים של סליל המשמשים לסגירת הלולאה מוצגים גם הם. כל זוג סלילים מורכב משני סלילים עגולים עם רדיוסשל30 ס"מ ו- N = 50 סיבובים של חוטי נחושת AWG-14. מגנטומטר שלושה צירים (חיישן) עם קנה מידה לבחירה (± 88 μT כדי ± 810 μT) ממוקם קרוב למרכז ערכת הסליל. טווח החיישנים מוגדר לערכים הנעים ±130 μT. ערכים אלה שימשו גם למדידות המתוארות בתוצאות הייצוגיות (בתנאים אלה, רזולוציית החיישן הנומינלי היא כ- 0.1 μT). האינטנסיביות והכיוון של השדה המגנטי נשלטים באמצעות מערכת משוב דיגיטלית. החיישן מודד את שלושת המרכיבים של וקטור השדה המגנטי (שלושת הצירים), ואותות השגיאה המתאימים מופקים. לאחר מכן, אותות התיקון נוצרים על-ידי מסנן אינטגרטור פשוט. אותות התיקון הדיגיטלי מומרים למתח על-ידי ממיר דיגיטלי לאנלוגי ומוגברים על-ידי מנהל התקן סליל מתאים. האותות האחרונים האלה משמשים לנהיגת זוגות הלמהולץ. תדר הדגימה קבוע ל-5 הרץ ותדירות הגבר האחדות של הלולאות היא כ-0.16 הרץ. לאחר הגדרת הזרמים בזוגות הלמהולץ של סלילי הלמהולץ, השדה המגנטי הכולל משתנה פחות מ-2% מערך העוצמה הממוצע שלו בנפח המעוקב המרכזי (עם קצה [L] = 10 ס"מ) של סלילי. במהלך המדידות, השדה המגנטי rms הוא פחות מ 0.2 μT. בשני הכיוונים (לוחות A ו- B)שדה חשמלי סטטי נוצר על ידי הזרם בסלילים המייצרים את השדה המגנטי. עוצמת השדה החשמלי היא כ- 0.4 V/m בעת החלת הזרם המרבי; ערך זה הוא זניח בהשוואה לשדות סטטיים טבעיים או מלאכותיים הקיימים בסביבה שעוצמתם היא בסדר גודל של 1 kV/m.

איור 2: תרשים של קצבי הזרימה המשמשים במהלך הבדיקות כדי לקבוע את הסף הריאאוטקטי של דגי הזברה. הזרימה במהלך תקופת התאקלמות של שעה הספיקה כדי להבטיח אספקת חמצן נאותה לבעלי החיים. ניתן להניח כי, עם עיצוב זה, אספקת חמצן היא אף פעם לא מגבלה, אפילו בשלב הראשון 10 דקות עם זרימה 0. אכן, עם תכולת חמצן של מים ב 27 °C (77 °F) של כ 7.9 מ"ג / ליטר וצריכת חמצן מן החי של 1 מ"ג / h.g (קירוב עודף לצריכת חמצן זברה הן בתנאים שגרתיים והן בשחייה במהירות נמוכה), ניתן לחשב כי, בהיעדר זרימה, Po₂ ב flume לא יפחת יותר מ 2% לכל בעל חיים, נשאר הרבה מעל קריטי Po₂ (כ 40 טור עבור זברה).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat