Ablación hepática dirigida: Inducción de la muerte de hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra

Overview

El artículo describe la ablación hepática dirigida, un método para inducir la muerte por hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra. El protocolo de muestra describe el proceso para generar, manipular y evaluar la ablación hepática dirigida en peces cebra.

Protocol

1. Preparación de embriones/larvas

1. Transfiera 100 embriones a una placa de Petri de 100 mm con 25 ml de agua de huevo. Mantenga no más de 100 embriones por placa de Petri y eleve a 28 °C.
2. Para inhibir la pigmentación, agregue feniltiourea (PTU) en las placas de Petri antes de las 10 horas posteriores a la fertilización (HPF), y levante embriones/larvas hasta 80 HPF. La concentración final de PTU es de 0,2 mM.
   PRECAUCIÓN: La PTU es tóxica. Utilí con arreglo a las directrices de manipulación adecuadas.
3. Anestesiar las larvas añadiendo éster etílico de ácido benzoico 3-amino (Tricaine), a una concentración final de 0,016%, en las placas de Petri. Luego, usando un microscopio de epifluorescencia, ordene larvas positivas para PPC. Use larvas con un tamaño de hígado similar y deseche aquellas con un hígado más pequeño o más grande.
   NOTA: cualquier larva cfp positiva, independientemente de la intensidad, se puede utilizar porque no hay diferencia en el alcance de la ablación con hepatocitos entre las larvas hemicigógo y homocigóus.
   PRECAUCIÓN: la tricarina es tóxica. Utilí con arreglo a las directrices de manipulación adecuadas.
4. Retire el agua de huevo que contiene Tricaine y agregue agua de huevo complementada con 0,2 mM PTU. Mantenga los embriones/larvas a 28 °C.

2. Tratamiento Mtz

1. Preparar solución fresca de 10 mM Mtz disolviendo 0,171 g de polvo de Mtz en 100 ml de agua de huevo complementada con 0,2% DMSO y 0,2 mM PTU. Para disolver completamente el Mtz, mezcle la solución en RT con una agitación rápida durante 20-30 minutos. Para ayudar a solubilizar Mtz y mejorar la permeación de Mtz en las larvas, agregue DMSO al preparar Mtz.
   PRECAUCIÓN: la exposición prolongada o el aumento de la concentración de Mtz es tóxico. Utilí con arreglo a las directrices de manipulación adecuadas.
2. Separe las larvas en grupos de control y experimentales transfiriendo el número deseado de larvas a dos placas de Petri de 100 mm diferentes o placas de varios pozos. Para el grupo experimental, mantenga las larvas en solución Mtz de 10 mM; para el grupo de control, manténgalos en agua de huevo que contenga 0.2% DMSO.
3. Cubra las placas o placas petri que contienen la solución Mtz con papel de aluminio para evitar la fotoinactivación de Mtz, e incubar a 28 °C. La duración del tratamiento con Mtz depende de la etapa larvaria y de la línea transgénica.

3. Análisis de la regeneración hepática impulsada por Biliary

1. Al final del período de ablación, retire la solución Mtz de las placas. Lave las larvas tratadas con Mtz añadiendo 25 ml de agua de huevo. Arremolina el plato 2-3 veces para lavar las larvas antes de desechar el agua del huevo. Repita tres veces y luego sumerja las larvas una vez más en agua de huevo. Para evitar el edema cardíaco y la muerte larvaria en las larvas tratadas con Mtz, añadir una menor concentración de Tricaine, a una concentración final del 0,008%, para inmovilizar las larvas.
2. Para el análisis hepático, examine el tamaño del hígado de las larvas tratadas con Mtz bajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro CFP. Evaluar los niveles de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado: grande (no ablated; 0-10% larvas), medio (parcialmente ablated; 10-20%), y muy pequeño (completamente ablated; 80-90%).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA