Overview
Este vídeo descreve uma técnica de injeção intraperitoneal, um método para fornecer soluções na cavidade abdominal do zebrafish adulto.
Protocol
1. Infecção experimental de M. marinum com injeção intraperitoneal
- Pipeta uma gota de 5 μL da solução bacteriana diluída em um pedaço de filme parafilme e puxe a gota em uma agulha de insulina de 30 G.
- Use peixes mutantes de 5 a 8 meses de idade e rag1−/−hu1999 para o experimento. Anestesiar o zebrafish adulto na água do tanque com 0,02% 3-aminobenzoicos ácido estil ester (pH 7.0). Posicione o lado ventral do peixe em uma fenda em um plástico espumoso úmido.
NOTA: Os peixes mutantes não são capazes de sofrer recombinação somática e produzir células T e B funcionais. - Injete a agulha entre as aletas pélvicas em um ângulo de aproximadamente 45°. Mantenha a agulha aberta para cima para observar que toda a abertura está dentro da cavidade abdominal. Injete lentamente a suspensão bacteriana e remova cuidadosamente a agulha.
NOTA: Caso o rastreador vermelho esteja vazando do peixe após a injeção, exclua o peixe do experimento. - Imediatamente após a injeção, transfira o peixe para um tanque de recuperação com água fresca do tanque.
- Pegue amostras da suspensão bacteriana em placas 7H10 a cada 15 minutos da alíquota bacteriana em uso e incubar as bactérias a 29 °C por 5 dias e verifique a dose de infecção contando as colônias nas placas.
- Verifique o bem-estar do peixe regularmente e eutanásia qualquer peixe com sintomas da infecção com mais de 0,02% de concentração de 3-aminobenzoicos ácido etil ester (pH 7.0).
NOTA: Aproximadamente, 7% dos zebrafish adultos infectados com 34 ± 15 UFC e 30% dos zebrafish infectados com 2029 ± 709 UFC terão sintomas em 8 semanas. Os sintomas podem incluir natação anormal, falta de resposta ao toque, ofegante, edema ou desperdiçamento observável. - Mantenha o zebrafish de acordo com os padrões comuns.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 |
