Preparación de muestras para metabolómica: un método para preparar muestras celulares para la elaboración de perfiles de metabolitos

Overview

Este video describe una técnica de preparación de muestras de células de cáncer de mama para el perfil de metabolitos. Las células del cáncer de mama se tratan con estradiol, que se une al receptor de estrógeno alfa y causa cambios en la composición del metabolito.

Protocol

1. Preparación de muestras de ensayo de metabolómica

1. Cultivo y tratamiento celular
   1. Semillas 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento. Para cada tratamiento preparar tres muestras. Utilice dos placas en cada muestra para recibir suficientes celdas para la detección. El día 3, retire el medio y agregue 5 ml de medio fresco con o sin 10^-8 M estradiol o E2 a las células. Tratar las células durante 24 horas (37 °C en ambiente humidificado 5% CO_2).
2. Colección de muestras
   1. Añadir 5 ml de hielo frío 1x PBS a la placa, aspirar el PBS después de inclinar brevemente la placa varias veces. Repita dos veces y retire tanto PBS como sea posible después del último lavado.
   2. Añadir 750 μl de acetona pre-fría a cada placa y raspar las células. Combine las células en acetona de dos placas en un tubo de 2 ml sobre hielo.
   3. Recuento celular para la normalización
      1. Para cada tratamiento, utilice dos placas adicionales para la cuantificación celular. Para desacoplar las celdas de la placa, agregue 2 ml de tampón HE (1x HBSS, HEPES de 10 mM, 0,075% NaHCO₃ y 1 mM EDTA) en cada placa e incubar durante 5 minutos.
      2. Recoja y mezcle bien las celdas canalizando las celdas en el búfer HE. Utilice un total de 20 μl de solución celular para contar el número de celda utilizando un hemociclomeciómetro.
3. Almacene las muestras a -80 °C antes de enviarlos al centro Metabolómico para identificar y cuantificar los metabolitos mediante el análisis de espectrometría de masas de cromatografía de gases (GC-MS).