Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em
Summary
La rana<em> Xenopus laevis</em> Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio<em> In vivo</emFacilitazione> di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.
Abstract
Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l'antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l'innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un'ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.
Protocol
Discussion
L'anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l'immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L'utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La zootecnia esperto fornito da Tina Martin e David Albright è apprezzati. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 dal NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
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