Comparativo In vivo Estudio de la gp96 adyuvante de la rana Xenopus laevis</em
Summary
La rana<em> Xenopus laevis</em> Ofrece una atractiva alternativa de animales no mamíferos modelo para explorar la capacidad de la proteína de choque térmico, tales como la gp96, para promover el antígeno específico de células T CD8. Se presentan métodos para el estudio<em> In vivo</em> Facilitación de presentación cruzada de antígenos de la piel y los tumores de gp96.
Abstract
Hemos desarrollado en el Xenopus laevis un único anfibio de animales no mamíferos modelo para estudiar la capacidad de ciertas proteínas de choque térmico (HSP), tales como la gp96, para facilitar la presentación cruzada de antígenos carabina y obtener respuestas T innata y adaptativa de la célula. Xenopus rechazo del injerto de piel proporciona una plataforma excelente para estudiar la capacidad de gp96 para obtener clásico MHC de clase Ia (clase Ia) limita las respuestas de células T. Además, el sistema modelo Xenopus también ofrece una alternativa atractiva a los ratones para explorar la capacidad de gp96 para generar respuestas frente a los tumores que se han reducido regulado su clase Ia moléculas para eludir la vigilancia inmune. Recientemente, hemos desarrollado un ensayo de células de la transferencia adoptiva de clones Xenopus utilizando leucocitos peritoneales como células presentadoras de antígeno (APC), y ha demostrado que puede gp96 primer T CD8 respuestas de las células in vivo contra los antígenos de histocompatibilidad menores piel, así como contra el tumor del timo Xenopus 15 / 0 que no expresan moléculas de clase I bis. Se describe aquí la metodología consistió en llevar a cabo estos ensayos incluida la transferencia de la obtención, pulso y adoptivos de leucocitos peritoneales, así como el injerto de piel y los ensayos de trasplante del tumor. Además también estamos describiendo la recolección y separación de los leucocitos de sangre periférica usado para citometría de flujo y ensayos de proliferación que permiten la caracterización de las poblaciones efectoras implicadas en el rechazo de piel y de las respuestas anti-tumorales.
Protocol
Discussion
El anfibio Xenopus es una singular versatilidad de animales no mamíferos modelo para estudiar la inmunidad. Su amplio uso en la investigación biomédica e inmunológica ha dado en diversas herramientas de investigación importantes, como los clones MHC define LG LG-6 y 15, así como diferentes líneas celulares y de anticuerpos monoclonales. El uso de estas herramientas se han establecido diferentes in vitro y en ensayos in vivo para estudiar la capacidad de las proteínas de choque…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La cría de animales peritajes a través de Tina Martin y David Albright es gratamente apreciados. Esta investigación fue apoyada por subvenciones T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 de los NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
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