DNA-איזוטופ יציב חיטוט היא שיטת טיפוח עצמאית לזהות ולאפיין הקהילות פעיל של מיקרואורגניזמים המסוגלים ניצול מצעים ספציפיים. הטמעת מצע מועשר באיזוטופ הכבד מוביל התאגדות של אטומים שכותרתו לתוך ביומסה של חיידקים. שיפוע ultracentrifugation צפיפות מאחזר DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד הזרם.
DNA-איזוטופ יציב חיטוט (DNA-SIP) היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי מיקרואורגניזמים פעיל להטמיע מצעים פחמן מסוים וחומרים מזינים לתוך ביומסה הסלולר. ככזה, זו טכניקה טיפוח עצמאית כבר מתודולוגיה חשוב עבור הקצאת פונקציה מטבולית של קהילות מגוונות המאכלסים מגוון רחב של סביבות יבשתי מימיים. לאחר דגירה של המדגם סביבתי עם איזוטופ יציב, תרכובות שכותרתו, חומצות גרעין חילוץ נתונה ultracentrifugation צפיפות שיפוע חלוקה הדרגתי לאחר נפרד חומצות גרעין של צפיפויות שונות. טיהור של ה-DNA של צזיום כלוריד מאחזר שכותרתו תווית ה-DNA לאפיון מולקולרי הבאים (לדוגמה, טביעת אצבע microarrays, ספריות שיבוט, metagenomics). פרוטוקול זה מספק וידאו יופיטר חזותי שלב אחר שלב ההסברים של פרוטוקול עבור שיפוע צפיפות חלוקה ultracentrifugation שיפוע, ושחזור של ה-DNA מסומן. הפרוטוקול כולל גם נתונים מדגם SIP ומדגיש טיפים חשובים מזהיר כי יש לקחת בחשבון כדי להבטיח ניתוח מוצלח SIP-DNA.
תכנון נכון של איזוטופ יציב ניסויים חיטוט היא בעלת חשיבות מכרעת לקבלת DNA שכותרתו לעיל הקהילה רקע תווית. שיקולים הקשורים מדגם פעמים הדגירה, ריכוז המצע, תנאי הדגירה (חומרים מזינים כגון לחות תוכן אדמה), בין האכלה שכפול נדונו במקום אחר 10,18 ו – אנו ממליצים להתייעץ עם הק?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט אסטרטגי ומענקים דיסקברי JDN מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |