מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.
Abstract
החשיבות של שימוש תאים ראשוניים, במקום שורות תאים סרטניים, ללימודים ביולוגיים הופך להכרה רחבה. תאים ראשוניים הם העדיפו במחקרים אפופטוזיס של מחזור התא, שליטה, תיקון דנ"א, כמו תאים סרטניים לשאת מוטציות בגנים המעורבים בתהליכים אלה. תאים ראשוניים לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן, בשל תחילת ההזדקנות replicative או aneuploidization. לפיכך, תרבויות חדשות צריכים להיות הוקמה על בסיס קבוע. ההליך עבור בידוד של fibroblasts מכרסם עובריים היא מבוססת היטב, אבל בידוד תרבויות פיברובלסטים מבוגרים לעתים קרובות אתגר. Fibroblasts מכרסם למבוגרים מבודדים מודלים העכבר של מחלות אנושיות יכולה להיות מלאה המועדפת כאשר משווים אותם fibroblasts מחולים האדם. יתר על כן, fibroblasts מבוגר הם חומר זמין רק כאשר עובדים עם מכרסמים בר שבו נשים בהריון לא ניתן להשיג בקלות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד והתרבות של fibroblasts מבוגר מהעור מכרסם והריאות. השתמשנו בהצלחה הליך זה לבודד fibroblasts מתוך למעלה מעשרים מינים מכרסם מעכברים וחולדות מעבדה כדי מכרסמים בר כגון בונה, קיפוד, והסנאי.
Protocol
1. לפני שמתחילים לעקר מספריים מלקחיים עם אתנול 70%. המקום stirrer מגנטי קטן בתוך כוס 30 מ"ל, מכסים עם שתי שכבות של נייר, ועל החיטוי. הכן 28 יחידות וונש / mL מניות פתרון של Lib…
Discussion
Fibroblasts העיקרי רגיל לספק חלופה מצוינת הוקמה שורות תאים סרטניים מחקר ביולוגי. יתרון חשוב של fibroblasts היא שהם אינם נושאים מוטציות אונקוגנים ו מדכאי הגידול במחזור לשמור על שלמות התא מחסומים. זה עושה fibroblasts נורמלי מערכת המועדפת עבור המחקרים של ויסות מחזור התא, תיקון DNA, אפופט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד"ר סטיבן Austad למתן אותנו עם הגרסה הראשונה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
DMEM/F12 media
Invitrogen
11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified
Invitrogen
01437-036
The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic
Invitrogen
15420-096
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen
15140-122
Liberase TM Research Grade
Roche
05401127001
Replacement enzyme.
A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media
ATCC
30-203
The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).