Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.
Abstract
Die Bedeutung der Verwendung von primären Zellen, anstatt Krebszelllinien, für biologische Studien wird immer weithin anerkannt. Primäre Zellen sind in Studien der Kontrolle des Zellzyklus, Apoptose bevorzugt, und die DNA-Reparatur, wie Krebszellen Mutationen in Genen, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Primäre Zellen kann nicht unbegrenzt durch das Einsetzen der replikativen Seneszenz oder aneuploidization kultiviert werden. Daher müssen neue Kulturen regelmäßig ermittelt werden. Das Verfahren zur Isolierung von Nagetier embryonalen Fibroblasten ist gut etabliert, aber isoliert Erwachsenen Fibroblastenkulturen oft eine Herausforderung. Adult Nagetier Fibroblasten aus Mausmodellen menschlicher Erkrankungen isoliert kann eine bevorzugte gesteuert werden, wenn man sie zu Fibroblasten aus menschlichen Patienten. Darüber hinaus sind erwachsene Fibroblasten die einzige verfügbare Material bei der Arbeit mit wilden Nagetieren, wo schwangere Frauen nicht leicht erhalten werden kann. Hier bieten wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von adulten Fibroblasten von Nagern Haut und Lunge. Wir haben dieses Verfahren erfolgreich an Fibroblasten aus über zwanzig Nagetieren isoliert vom Labor Mäusen und Ratten zu wilden Nagetieren wie Biber, Stachelschwein und Eichhörnchen.
Protocol
1. Vor dem Start Sterilisieren Schere und Pinzette mit 70% Ethanol. Legen Sie kleine Magnetrührer in einem 30 mL Becherglas mit zwei Lagen Folie, und Autoklaven zu decken. Bereiten Sie eine 28 Wunsch-Einheiten / ml Stammlösung von Liberase Blendzyme 3 in sterilem Wasser. Machen Sie 0,5 ml und bei -20 ° C. Tauwetter ein neues Aliquot vor jedem Einsatz. Die Lösung kann trübe aussehen nach dem Auftauen. Vortex die Lösung, bis es klar wird. Warm up den Zellkulturmedien. </…
Discussion
Normale primären Fibroblasten bieten eine hervorragende Alternative zu den etablierten Zelllinien in der biologischen Forschung. Ein wichtiger Vorteil von Fibroblasten ist, dass sie nicht tragen Mutationen in Onkogenen und Tumor-Unterdrücker und pflegen intakten Zellzyklus-Kontrollpunkte. Dies macht normalen Fibroblasten eine bevorzugte System für das Studium der Regulation des Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose. Die hier beschriebene Protokoll bietet ein einfaches Rezept für die Isolierung und Wartung von prim?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Steven Austad, die uns mit der ersten Version dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
DMEM/F12 media
Invitrogen
11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified
Invitrogen
01437-036
The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic
Invitrogen
15420-096
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen
15140-122
Liberase TM Research Grade
Roche
05401127001
Replacement enzyme.
A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media
ATCC
30-203
The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).