Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.
Abstract
L'importanza di utilizzare cellule primarie, piuttosto che linee cellulari tumorali, per ricerche biologiche sta diventando ampiamente riconosciuto. Cellule primarie sono preferite in studi di controllo del ciclo cellulare, apoptosi, e la riparazione del DNA, le cellule tumorali sono portatori di mutazioni in geni coinvolti in questi processi. Cellule primarie non può essere coltivato a tempo indeterminato a causa della comparsa di senescenza replicativa o aneuploidization. Quindi, nuove culture devono essere stabiliti regolarmente. La procedura per l'isolamento di fibroblasti embrionali dei roditori è ben consolidata, ma isolando colture di fibroblasti adulti spesso è una sfida. Fibroblasti roditori adulti isolati da modelli murini di patologie umane può essere un controllo preferito quando li confronto a fibroblasti da pazienti umani. Inoltre, i fibroblasti adulti sono l'unico materiale a disposizione quando si lavora con i roditori selvatici in cui donne in gravidanza non possono essere facilmente ottenuto. Qui forniamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei fibroblasti adulti dalla pelle dei roditori e dei polmoni. Abbiamo usato questa procedura con successo per isolare fibroblasti da oltre venti specie di roditori da laboratorio, topi e ratti di roditori selvatici come il castoro, l'istrice e lo scoiattolo.
Protocol
1. Prima di partire Sterilizzare forbici e pinze con il 70% di etanolo. Piccolo agitatore magnetico all'interno di un bicchiere da 30 ml, coprire con due strati di stagnola, e autoclave. Preparare un 28 unità Wunsch / mL di soluzione stock Liberase Blendzyme 3 in acqua sterile. Fai aliquote 0,5 ml e congelare a -20 ° C. Scongelare un'aliquota di nuovo prima di ogni utilizzo. La soluzione potrebbe apparire torbida dopo lo scongelamento. Vortex la soluzione fino a quando diventa ch…
Discussion
Normali fibroblasti primari fornire un'ottima alternativa alle linee di cellule tumorali stabilito nella ricerca biologica. Un vantaggio importante dei fibroblasti è che non siano portatori di mutazioni in oncogeni e soppressori tumorali e mantenere intatti i punti di controllo del ciclo cellulare. Questo rende fibroblasti normale un sistema preferito per gli studi di regolazione del ciclo cellulare, la riparazione del DNA e l'apoptosi. Il protocollo qui descritto fornisce una ricetta semplice per l'isolame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Steven Austad per averci fornito la prima versione di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH e la Ellison Medical Foundation di VG e AS
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
DMEM/F12 media
Invitrogen
11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified
Invitrogen
01437-036
The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic
Invitrogen
15420-096
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen
15140-122
Liberase TM Research Grade
Roche
05401127001
Replacement enzyme.
A note from the authors:
Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media
ATCC
30-203
The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).