Summary
בידול בימוי של hESCs לתוך תאים ספציפיים יצרה עניין רב ברפואה רגנרטיבית. אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול לקביעת
Abstract
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת מוגבלת להתחדשות עצמית, את היכולת להתמיין לתאי נגזר כל שלוש שכבות נבט עובריים (1). בידול בימוי של hESCs לתוך סוגי תאים מסוימים יצרה עניין רב בתחום של רפואה רגנרטיבית (למשל, (2-5)), וכן שיטות לקביעת
Protocol
הפרוטוקול שנכתב להלן מתבסס על פרמטרים שפורסמו שדווחו על ידי המחברים, עם שינויים מסוימים. הפרוטוקול מתבצע באישור טיפול קליפורניה בסן פרנסיסקו מוסדיים בעלי חיים השתמש (IACUC) ו לתאי גזע למחקר ביקורת (SCRO) ועדות.
I. תרבות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs)
- לגדול hESCs ברמת 6-היטב (3.5 ס"מ קוטר הבארות) צלחות.
- לפחות 12 שעות לפני passaging תאים, עכבר פיברובלסטים זרע עובריים (MEF; המתקבל יום CF1 e12.5 עכברים מתוזמן-הזדווגו, מוקרן ב 1000 Ci) מזין תאים על גבי צלחות מצופה ג'לטין 1% (6,7). MEFs צריך להיות מצופה בנקודת המפגש 50-60%, או 4 x 10 5 תאים לכל בקוטר 3.5 ס"מ היטב (איור 1).
- מעבר מושבות תאים כאשר הגיעו מפגש ~ 70% (איור 2).
- למעבר תאים, בינוני לשאוב KSR צמיחה (6) מבארות ולהחליף בינוני 0.5 מ"ל המכיל collagenase הרביעי KSR בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
- דגירה צלחות עם collagenase IV ב 37 ° C / 5% CO 2 למשך 5 דקות או עד הקצוות של מושבות להתחיל להרים מן הצלחת.
- הסר collagenase IV מהצלחת, להוסיף 0.5 מ"ל של KSR היטב כל אחד, באופן ידני לגרד תאים כדי להסיר לחלוטין מן הצלחת.
- אסוף את ההשעיה תא ממקום אחד, גם בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל, ולאפשר לתאים להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant מהצינור, עוזב את תאים בינוניים בהיקף כולל של ~ 300μl.
- באמצעות סט 200 μl מיקרו pipettor במלוא העוצמה, בעדינות פיפטה ההשעיה תא 5-6 פעמים כדי לשבור את המושבות.
- תביאו את ההשעיה התא בהיקף כולל של 9 מ"ל לכל היטב המקורי של תאים באמצעות מדיום KSR (כלומר, אם גם הוא שנקטפו, הצינור אמור להכיל 9 מ"ל). במוסף בינוני עם רקומביננטי גורם גדילה פיברובלסטים אדם בסיסיות (bFGF) ריכוז של 12.5 ng / ml.
- לאחר שטיפת בארות חדשות המכיל תאים MEF (ראה שלב 2) עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) כדי להסיר את כל בסרום, להוסיף 3 מ"ל של ההשעיה תא זה טוב דגירה צלחות ב 37 ° CO 5 / 2%.
- שנה בינונית KSR עם bFGF 24 שעות לאחר המעבר, וכל 24-48 שעות עד תאים מוכנים passaged שוב.
השנייה. הכנת hESC גלולה עבור השתלת
- ב 24 שעות לפני השתלת, להוסיף מעכב רוק בינוני KSR לריכוז סופי של 10μM להגדיל את כדאיות התא (8). גם אחת של תאים בנקודת המפגש ~ 70% (5 x 10 5 תאים) יהיה ליצור שני כדורי, עם שני כדורי מוכנס לכל כמוסה בכליות.
- כדי להכין כדורי עבור השתלת תאים (9), דגירה מעכב שטופלו ROCK תרבויות עם collagenase IV במשך 5 דקות ב 37 מעלות CO 5 / 2%.
- לשאוב IV collagenase מהבאר ולהחליפו 1 DPBS מ"ל עם 10% פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס).
- ידנית לגרד את מושבות מהצלחת, לשטוף היטב עם 1 DPBS נוסף מ"ל עם עט / סטרפטוקוקוס, והעברת כל aliquot 1ml של השעיה לתא צינור microfuge 1.5 מ"ל.
- ספין צינורות microfuge בקצרה ב 8000 x גרם, לשאוב supernatant ו resuspend את כדורי ב DPBS 500μl עם עט / סטרפטוקוקוס.
- כדי לעזור לאגד את התאים יחד להשתלה, להוסיף 100μl 1 מ"ג / מ"ל לקטינים Phaseolus vulgaris (PHA) ב DPBS אל צינור אחד.
- דגירה התא / השעיה PHA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ולאחר מכן ספין 2 דקות ב 8000 x גרם. סובב את צינורות 180 מעלות בתוך בארות הרוטור שלהם ספין שוב במשך 2 דקות ב 8000 x גרם.
- בזהירות לשאוב supernatant עוזב גלולה ללא פגע.
- לעקור את כדורי תא מן הצינורות על ידי בעדינות pipetting KSR 200μl ליד הקצה של גלולה עד לאט מרים.
- וחילצה פעם אחת, מיד להעביר את כדורי אל 0.4μm מוסיף MILLICELL להציב בקוטר 3.5 ס"מ בארות המכיל 3 KSR מ"ל, ו דגירה עבור 2 שעות הלילה בשעה 37 ° C / 5% CO 2.
ג. הקפסולה השתלת כליה
- בצע את כל הנהלים בעל חיים בהתאם להנחיות מוסדיים באמצעות הטכניקה aseptic המתאים.
- הרדימי עכברים בז' SCID (CB17.Cg-Prkdc SCID Lyst bg / CRL), בגילאי 8-12 שבועות, באמצעות שילוב של 3% O2 בשאיפה isoflurane/0.5% ו tribromoethanol intraperitoneal (Avertin: 25 מ"ג / ק"ג מוכן טרי). שני כדורי תא לכל עכבר יהיה engrafted באמצעות הטכניקות המתוארות (10).
- לאחר הצבת העכבר על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה, לגלח את אזור החתך, ולאחר מכן לחטא את זה עם chlorhexidine. ביצוע חתך 2.5 ס"מ דרך העור ממש ליד מרכז אך במקביל לעמוד השדרה.
- שמירה על לחות באזור החתך עם סלין סטרילידואר, לעשות חתך קטן יותר דרך השריר, ממש מתחת לצלעות ו ~ 1 ס"מ מעמוד השדרה. החתך צריך להיות גדול מספיק כדי למשוך את הכליה דרך, אך קטן מספיק כי הכליה לא להחליק בחזרה לתוך חלל הבטן ללא כוח.
- משוך את הכליה בעדינות דרך חתך השריר באמצעות פיפטה פסטר זכוכית כי כבר משך לצורה של וו, בוטה מעוקל מעט.
- להרטיב את הכליות עם DPBS סטרילי כדי למנוע את הקפסולה מהתייבשות. זה עשוי להיות נחוץ כדי לחזור לאורך ההליך, כמו הקפסולה היא שברירית מאוד.
- בעזרת מלקחיים דומון # 5, משוך בעדינות את הקפסולה מן הכליות ולגרום חתך 2 מ"מ באמצעות מספריים Vannas האביב.
- בעזרת פיפטה כוס נוספת כי כבר נכנס בדיקה, יפה מאוד קהה, לעשות כיס קטן בין הקפסולה ואת הכליות.
- בעזרת טיפ גדול פתח פיפטה דגש על פיפטה העברה חד פעמיות, לקחת גלולה תא בודד להכניס את MILLICELL. הקפד לקחת את המדיה כמו תוספת קטנה יחד ככל האפשר, כמו התקשורת עודף עלול להפריע להעברת גלולה.
- בעוד והרים את שולי החתך כדי ליצור את הכיס בעדינות במקום גלולה לצד פתיחת ולדחוף אותה לכיס כלפי מקוטב אחד של הכליה עם פיפטה ומשכה.
- חזור על התהליך עם גלולה נוספת. המקום הזה תחת הקפסולה של הכליה זהה, אך כלפי הקוטב הנגדי.
- בזהירות מקום הקפסולה בחזרה למטה, אל כדורי. כדורי צריכה להישאר בתוך הכיס, ואת התפרים אין צורך לסגור את הקפסולה.
- דחף בעדינות את הכליה חזרה לתוך חלל הבטן ולסגור את קיר השרירים באמצעות תפרים משי 4-0 (או יותר) עם מחט הפוכה חיתוך המצורפת. החתך צריך להיות קטן מספיק, כי רק תפר אחד הוא הכרחי.
- סגור את העור עם שורה של תפרים קטע 4-5, באמצעות חומר תפר אותו.
- לפני הצבת העכבר לכלוב שלו, לנהל 0.05 מ"ג / ק"ג עצירות (11,12) ו - 5 מ"ג / ק"ג ketoprofen (12,13) כמו משככי כאבים לטווח הקצר ולטווח הארוך, בהתאמה. חומרים מפוקחים יש להשתמש רק בהתאם להנחיות מוסדיים.
- מעבירים את החיה בחזרה לכלוב שלה ולאפשר לו להתאושש מן ההרדמה על כרית חימום. זה אמור לקחת בערך 20-30 דקות.
- לאחר העכבר הוא אמבולטורי מלא, זה יכול להיות שב למתקן דיור בעלי חיים.
IV. קציר תפלצת רוחנית, קיבעון ו חתך
- בשעה 8-12 שבועות לאחר הניתוח, צריך להיות תפלצת רוחנית מוחשית בקושי באזור הכליות. גדולות, מלאות נוזל ציסטות לעיתים קרובות לפתח גם כן, החל מהשעה 6-8 שבועות. אלה עשויים להצריך הקציר קודם אם הם לגרום למצוקה לחיה. מאז teratomas לצמוח בקצב איטי יותר מאשר ציסטות, לעומת זאת, אתה רוצה לחכות זמן רב ככל האפשר כדי להשיג תפלצת בגודל מספיק לניתוח (כלומר, לפחות 8 שבועות).
- הסר את הכליות, תפלצת רוחנית, וכל ציסטות מסביב כמו גוש של רקמה מחלל הבטן באמצעות גישה ניתוחית דומה שבאמצעותו כליות היה לגשת במקור (ראה סעיף III, שלבים 1-4 לעיל).
- מניחים את כל גוש של רקמת נכרת לתוך צינור המכיל 10% שנאגרו פורמלין.
- תפלצת אפשר לתקן את הלילה בבית 4 ° C.
- למחרת, להסיר את תפלצת מהצינור. משם לנתח כל ציסטות בכליות ככל האפשר מבלי לפגוע תפלצת עצמו (איור 3). Teratomas מוגדלת עשוי להיות בחצי כדי להקל על דיסקציה והטבעה.
- תהליך תפלצת בטכניקה תקן פרפין קיבעון. יחידות אוטומטיים זמינים (לדוגמה, Hypercenter Shandon):
I. 80% אלכוהול Flex 2 שעות השנייה. 80% אלכוהול Flex 1 שעה ג. 85% אלכוהול Flex 1.5 שעות IV. 95% אלכוהול Flex 1 שעה V. 100% אלכוהול Flex 1 שעה VI. 100% אלכוהול Flex 1 שעה VII. 100% אלכוהול Flex 1 שעה VIII. נקה-Rite 3 1 שעה IX. נקה-Rite 3 1 שעה X. נקה-Rite 3 1 שעה XI. פרפין (TissuePrep) 2 שעות XII. פרפין (TissuePrep) 2 שעות
V. אימונוהיסטוכימיה וניתוח
- לאחר ההטבעה בסעיף פרפין, תפלצת רוחנית בתוך פרוסות סדרתי 5μm באמצעות microtome סיבובית, וחתכים לצוף על גבי שקופיות.
- לפני מכתים, לאפות את השקופיות לפחות שעה אחת.
- הכתם השקופיות עם hematoxylin ו eosin באמצעות שיטות סטנדרטיות לזהות מבנים רקמות נציג של כל אחת משלוש שכבות נבט עובריים (איור 4):
I. קסילן לשטוף 3-5 דקות השנייה. קסילן 3-5 דקות ג. 100% אלכוהול 3-5 דקות IV. 100% אלכוהול 3-5 דקות V. 95% אלכוהול 3-5 דקות VI. 80% אלכוהול 3-5 דקות VII. לשטוף במים (כמה שינויים) 2 דקות VIII. גיל של Hematoxylin # 3 2-5 דקות IX. לשטוף במים (כמה שינויים) עד שהמים פועל ברור X. סקוט של מים (כדי גרעינים כחול) 3 דקות או יותר XI. לשטוף במים (כמה שינויים) 1-2 דקות XII. Eosin Y 1 דקה XIII. לשטוף במים (כמה שינויים) 30 שניות XIV. 80% אלכוהול 1 דקה XV. 95% אלכוהול 2 דקות השישה עשר. 95% אלכוהול 2 דקות י"ז. 100% אלכוהול 3 דקות XVIII. 100% אלכוהול (נקי) 3 דקות XIX. קסילן 2 דקות או יותר XX. קסילן 2 דקות או יותר - הר coverslip בכל שקופית עם Permount.
VI. נציג תוצאות
באיור 1. ציפוי של CF1 fibroblasts מוקרן עכבר עובריים כשכבת מזין עבור hESCs culturing מובחן. MEFs הם מצופה בנקודת המפגש ~ 50%, כפי שמוצג כאן, או 4 x 10 5 תאים לכל בקוטר 3.5 ס"מ היטב בקערה 6-גם תרבות. בר, 100 מיקרומטר.
איור 2. HESCs דוגמה לתרבות subconfluent של hESCs מובחן על שכבת מזין MEF. מגודלים על שכבות MEF מזין עד ומחוברות ~ 70%, כפי שמוצג כאן, אז passaged כמתואר. בר, 100 מיקרומטר.
איור 3. דוגמה teratomas explanted. בעקבות explantation, תפלצת, כליות, וכל רקמה אביזר קבועים כאבן בפורמלין, אז הכליה ורקמת אביזר הם גזומים בקפידה משם לפני הטבעה ב פרפין.
איור 4. Teratomas נגזר hESCs מובחן מכילים רקמות מייצג של כל שכבות נבט שלושה vivo. תפלצת רוחנית, כמו זה המתואר באיור 3, נותח ומוכתמים hematoxylin ו eosin לזהות רקמות עובריים. hESCs להצמיח רקמות נגזר כל שלוש שכבות נבט עובריים (האאקטודרם (A, B), והמזודרם (C), האנדודרם (ד). (א) צינור ינוקא המבנה העצבי. (ב) קשקש פרימיטיביים האפיתל. (ג) סחוס מוקף קפסולה של mesenchyme מרוכז. (ד) מבנה המעי הבלוטות. בר, 100 מיקרומטר. תמונות והודפס מחדש באישור המחבר.
איור 5. ניתוח תפלצת רוחנית יכולה לשמש מפת גורל, hESCs מתויג מובחן. כפי שפורסם בעבר (9), תערובת של hESCs מתויג במיוחד עם hESCs לא מתוייגת ניתן למפות את גורלם של תאים מתויג assay היווצרות תפלצת רוחנית. כפי שמוצג כאן, hESCs מובחן להביע את הסמן פני השטח, CD133 ו מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP), היו מעורבים עם, לא מתוייגת hESCs מובחן. אלה שימשו כדי ליצור teratomas על ידי השתלת כליות כמוסה. ניתוח immunohistochemical של hematoxylin ו eosin מוכתם סעיפים תפלצת עם נוגדן אנטי eGFP מדגים את גורל neuroectodermal של CD133 hESCs +. Teratomas עובדו באיור 4 ו counterstained עם נוגדן אנטי eGFP (חום) למקם נגזרות של CD133 + + ה-GFP בתאים בתוך רקמות. CD133 + הנגזרות תאים (חיצים) נצפו ברקמות הנובעים האאקטודרם עובריים, אפיתל עצביים במיוחד (משמאל) המתהווה הצינור העצבי מבנים דמויי (מימין). בר, 100 מיקרומטר. תמונות והודפס מחדש באישור המחבר.
לטין
- 0.1% חזירי ג'לטין
- 99.9% DPBS
- מוסיפים ג'לטין כדי DPBS, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה או עד שכל הג'לטין נכנס פתרון, ולסנן לעקר (0.22μm) לפני השימוש.
MEF בינוני
- 10% בסרום שור עוברית (מוסמך)
- Dulbecco 90% של השתנה בינוני חיוניים (D-ממ)
- 1x-L-גלוטמין
- 1x פן / סטרפטוקוקוס
- סנן לחטא לפני השימוש.
KSR (החלפת נוק סרום) בינוני
- 20% סרום בנוקאאוט החלפת
- 80% בנוקאאוט D-ממ
- 1x-L-גלוטמין
- 1x חומצות אמינו חיוניות
- 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol /
- 12.5 ng / ml bFGF
- סנן לעקר.
- חנות ב 4 ° C, אבל חם 37 ° C לפני הוספת לתאים.
- הוסף bFGF מיד לפני השימוש.
Collagenase IV
- ממיסים 1 מ"ג / מ"ל במדיום KSR ידי הצבת על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות או עד אבקה כל נכנס הפתרון.
- סנן לעקר.
Avertin
- 0.25 גר '2,2,2-tribromoethanol
- 0.25 מ"ל 2-methyl-2-butanol
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי ליצור פתרון של 100%.
- כמה שעות לפני הניתוח, כדי לדלל 2.5% הפתרון עובד באמצעות DPBS ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
- סנן מחטאים aliquot.
- Tribromoethanol הוא מאוד רגיש לאור, כדי להגן מפני אור בכל שלבי ההכנה והשימוש.
- הכינו לא יותר מ 12-24 שעות לפני השימוש.
עצירות
- 1 מ"ג / מ"ל פתרון המניות מתנול
- מדולל עד 0.015 מ"ג / מ"ל עובד באמצעות פתרון סטרילי H 2 O.
- חנות ב -20 ° C עד חודש 1.
Ketoprofen
- 0.5 מ"ג / מ"ל פתרון עובד DPBS
- הוסף DPBS, דגירה לילה בשעה 37 ° C במשך 1-2 שעות או עד אבקה כל נכנס הפתרון.
- סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
Discussion
יש לנו התאמה במבנה היעילה ביותר תפלצת assay לצורך מיפוי גורלו של הבחנה hESCs ב בסביבה vivo. מספר קטן של hESCs שנבחרו במיוחד הוא מעורבב עם סוג מובחן hESCs בר לקטינים vulgaris Phaseolus כדי ליצור גלולה התא. זהו מורכבים מתחת הקפסולה כליה עכבר immunodeficient. גורלם של hESCs שנבחר במקור אז יכול להיות נקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 5), כפי שדווח בעבר (9). שיטה זו מספקת כלי רב ערך לזיהוי ויצירת רקמת ריאגנטים ספציפיים לטיפול מבוססי תאים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר מקיף של המכון בקליפורניה הרגנרציה לרפואה (RC1-00104), שירות הבריאות הציבורי גרנט (HL085377) מ NHLBI, ואת מתנת קרן Pollin ל HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
