Summary
특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를 제공합니다
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)은 자기 갱신에 대한 무제한 용량, 삼배 배아 레이어 (1)에서 파생된 세포로 차별화할 수있는 능력이 있습니다. 특정 세포 유형으로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학의 분야 (예, (2-5))에 많은 관심을 생성하고,을 결정하는 방법이
Protocol
아래 서면 프로토콜은 일부 수정, 저자에 의해보고되는 출판 매개 변수를 기반으로합니다. 프로토콜은 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용 (IACUC)와 줄기 세포 연구 감독 (SCRO)위원회의 승인과 함께 수행됩니다.
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 I. 문화
- 표준 6 자 (3.5 cm 직경 웰스) 접시에 hESCs 성장.
- 접시에 피더 세포 1퍼센트 젤라틴 (6,7)로 코팅, 최소한 12 시간 전에 세포, 종자 마우스 배아 fibroblast (CF1 일 ~ 1000 CI에서 조사 e12.5 초과 - 성관계를 마우스를 얻은 MEF)은 passaging 수 있습니다. MEFs는 50-60%의 합류, 또는 4 도금되어야 물론 3.5 ㎝ 직경 당 X 10 5 세포 (그림 1).
- 패시지 식민지 ~ 70 %의 합류 (그림 2)에 도달했습니다 세포.
- 통과하려면 전지, 기음 KSR 성장 우물에서 매체 (6) 1 MG / ML의 농도에 KSR에서 Collagenase IV를 포함하는 0.5 ML 매체로 바꿉니다.
- 37 Collagenase IV와 접시를 품어 ° C / 5 %는 5 분 동안이나 식민지의 가장자리까지 CO 2 판에서 리프트로 시작합니다.
- 접시에서 Collagenase IV를 제거, 각 잘하는 KSR 0.5 ML를 추가하고, 수동으로 완전히 판에서 제거하는 세포를 다쳤어요.
- 15 ML 원뿔 관에서 각 물론, 장소의 세포 현탁액을 수집하고, 세포가 5 분 중력에 의해 해결하실 수 있습니다.
- ~ 300μl의 총 볼륨의 세포와 매체를 떠나, 튜브의 표면에 뜨는를 제거합니다.
- 전체 볼륨에 200 μl 마이크로 pipettor 집합을 사용하여 부드럽게 식민지를 깰 수있는 세포 현탁액에게 5-6 번 피펫.
- KSR 미디어를 (즉, 하나가 잘 수확 경우, 튜브 9 ML을 포함한다)를 사용하여 세포의 원래 잘 당 9 ML 총 볼륨에 세포 현탁액을 가져와. 12.5 NG / ML의 농도로 재조합 인간의 기본적인 fibroblast의 성장 인자 (bFGF)와 매체를 보완.
- Dulbecco의 인산염과 MEF 세포를 (단계 2 참조)이있는 새 우물을 세척 후, 모든 혈청을 제거 각각 잘 수있는 세포 현탁액 3 ML을 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 접시를 부화 (DPBS) 살린 버퍼.
- 세포가 다시 passaged 준비되기 전까지는 bFGF 통과 후 24 시간, 모든 24-48시간과 KSR 매체를 변경합니다.
II. 접목에 대한 hESC 펠릿의 준비
- 접목 전에 24 시간, 세포 생존 (8)을 높이기 위해 10μM의 최종 농도 KSR 매체에 바위 억제제를 추가합니다. 잘 ~ 70 % 합류 (5 X 10 5 세포)에서 세포 중 하나가 신장 캡슐 당 삽입이 알약과 함께 두 개의 알약을 만들어 낼 것입니다.
- (9)를 접목에 대한 세포 알약을 준비하려면 37에서 5 분 Collagenase IV와 바위 억제제 - 처리 문화를 품어 ° C / 5 % CO 2.
- 우물에서 Collagenase IV를 대기음와 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / strep) 1 ML의 DPBS로 바꿉니다.
- 수동 접시에서 식민지를 밀고, 펜 / strep와 함께 추가 1 ML DPBS로 잘 씻어하고, 1.5 ML의 microfuge 튜브에 세포 현탁액의 각 1ml 나누어지는를 전송.
- 8,000 X g에서 간략하게 microfuge 튜브를 스핀, 뜨는을 기음, 그리고 볼펜 / strep와 500μl DPBS에서 알약을 resuspend.
- 이식을 위해 함께 세포를 바인딩할 수 있도록, 각각의 튜브에 DPBS에 100μl 1 MG / ML Phaseolus vulgaris의의 렉틴 (PHA)를 추가합니다.
- 5 분 실온에서 셀 / PHA 서스펜션을 품어 후 8,000 X g에서 2 분간 돌린다. 자신의 로터 웰스 이내 튜브 180 ° 회전하고 8,000 X g에서 2 분간 다시 스핀.
- 조심스럽게 펠렛은 그대로두고 표면에 뜨는를 대기음.
- 그것이 서서히 리프트 때까지 부드럽게 펠렛의 가장자리 옆에 200μl KSR를 pipetting하여 튜브에서 세포 알약을 이동시키다.
- 일단 dislodged 즉시 3 ML의 KSR를 포함하는 3.5 ㎝의 직경 우물에 위치 0.4μm MILLICELL 삽입에 알약을 전송하고, 37 ° C / 5% CO 2에서 하루 2 시간 동안 부화.
III. 접목 신장 캡슐
- 적절한 무균 기술을 사용하는 기관 지침에 따라 모든 동물 절차를 수행합니다.
- 흡입 3퍼센트 isoflurane/0.5 %의 O2와 intraperitoneal tribromoethanol (; 25 MG / 신선한 kg Avertin)의 조합을 사용하여 8-12주 세 SCID 마우스 베이지 (CB17.Cg - Prkdc scid Lyst BG / CRL)을, 마취. 마우스마다 두 개의 세포 펠렛은 설명 기술 (10)를 사용 engrafted 것입니다.
- 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에서 마우스를 배치 후, 절개의 영역을 면도 후, chlorhexidine로 소독. 단지 중심에서 피부지만 척추에 평행으로 2.5 cm의 절개를합니다.
- 무균 살랑로 절개 영역 습기를 유지E, 그냥 척추에서 갈비와 ~ 1cm 아래의 근육을 통해 작은 절개를합니다. 절개는 통해 신장시킬만큼 큰 단지지만, 신장이 강제없이 복강에 다시 슬립하지 않을 정도로 작은되어야합니다.
- 무딘, 약간 굽은 갈고리 모양으로 뽑아왔다 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 근육 절개를 통해 부드럽게 신장을 당겨.
- 밖으로 건조에서 캡슐을 방지하기 위해 무균 DPBS과 신장 젖었어. 이것은 캡슐이 매우 불안정으로 절차 전반에 걸쳐 반복해야 할 수도 있습니다.
- 더몬트 # 5 포셉를 사용하면 부드럽게 신장에서 캡슐을 끌어와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 2mm 절개를합니다.
- 아주 좋아, 무딘 프로브로 뽑아왔다 다른 유리 피펫으로 캡슐과 신장 사이에 작은 주머니합니다.
- 일회용 전송 피펫에 배치 큰 구멍 피펫 팁을 사용 MILLICELL 삽입에서 단일 세포 펠렛을. 초과 미디어 펠렛 전송을 방해할 수 있으므로, 가능한 한 함께 약간의 여분의 미디어가 소요될해야합니다.
- 주머니를 만들 절개의 가장자리를 잡고 있지만, 부드럽게 열고 옆에있는 펠렛을 배치하고 뽑아 피펫으로 신장 중 하나 극쪽으로 주머니에 밀어.
- 두 번째 펠렛으로 과정을 반복합니다. 같은 신장의 캡슐에 따라이 곳에 있지만, 반대 극쪽으로.
- 알약에 다시 아래로 캡슐을 조심스럽게 넣습니다. 산탄은 주머니 안에 있어야하고, 더 봉합은 캡슐을 닫을 필요가 없습니다.
- 부드럽게 복강에 다시 신장을 눌러 및 첨부 리버스 절삭 바늘로 4-0 실크 봉합 (이하)를 사용하여 근육 벽을 닫습니다. 절개는 하나의 치료가 필요하다고 정도로 작은되어야합니다.
- 같은 봉합사 재료를 사용하여 4-5 중단 바늘의 일련의 피부를 닫습니다.
- 의 케이지에 다시 마우스를 배치하기 전에, 각각, 단기 및 장기 진통제로 0.05 밀리그램 / kg buprenorphine (11,12) 5 밀리그램 / kg 케토프로펜 (12,13)를 관리할 수 있습니다. 제어 물질은 기관 지침에 따라 사용해야합니다.
- 그 케이지 다시 동물을 전송하고 가열 패드에 마취에서 회복 수 있습니다. 이 20-30분 정도 걸릴 것입니다.
- 마우스 완전히 외래되면, 그것은 동물의 주거 시설로 제공될 수 있습니다.
IV. 기형 종의 수확, 고정 및 sectioning
- 8~12주 수술에서 신장 근처에 거의 만져서 알 수있는 기형 종이 있어야합니다. 대형, 유체 - 채워진 cysts 종종 6~8주에서 시작뿐만 아니라 개발합니다. 그들은 동물에게 고통을 일으킬 경우 이들은 이전 수확 할거 수 있습니다. 기형종가 cysts보다 느린 속도로 성장 때문에, 그러나, 당신은 분석을 위해 충분한 크기 (즉, 최소한 8 주)의 기형 종을 얻기 위해 가능한 한 오랫동안 기다리는 것이 좋습니다.
- 신장, 기형 종, 그리고 신장이 원래 액세스할되었던하여 동일한 수술 방법을 사용하여 복강에서 조직의 블록 같은 주변 cysts를 제거합니다 (제 III를 참조하십시오, 위의 1-4 단계).
- 10 % 포르말린 버퍼가 들어있는 튜브에 excised 조직의 전체 블록을 배치합니다.
- 기형 종은 4 밤새 수정을 허용 ° C.를
- 다음날, 튜브에서 기형 종을 제거하십시오. 기형 종 자체 (그림 3)을 손상하지 않고 가능한 모든 cysts과 많은 신장 멀리 해부하다. 큰 기형종은 절개와 삽입을 촉진하기 반으로 수 있습니다.
- 표준 파라핀 - 고정 기법을 사용하여 기형 종을 처리합니다. 자동 단위 (예 : 쉔던 Hypercenter)을 사용할 수 있습니다
I. 80% 플렉스 알콜 이시간 II. 80% 플렉스 알콜 일시간 III. 85% 플렉스 알콜 1.5 시간 IV. 95% 플렉스 알콜 일시간 V. 백퍼센트 플렉스 알콜 일시간 VI. 백퍼센트 플렉스 알콜 일시간 VII. 백퍼센트 플렉스 알콜 일시간 VIII. 클리어 라이트 3 일시간 IX. 클리어 라이트 3 일시간 X. 클리어 라이트 3 일시간 XI. 파라핀 (TissuePrep) 이시간 XII. 파라핀 (TissuePrep) 이시간
V. Immunohistochemistry 및 분석
- 일단 슬라이드에 파라핀 섹션 로타리 마이크로톰를 사용하여 5μm 시리얼 조각의 기형 종과 부동 섹션에 포함된.
- 얼룩 전에 적어도 한 시간 동안 슬라이드를 구워.
- 삼배 배아 레이어 (그림 4)의 각각의 대표적인 조직 구조를 식별하는 표준 방법을 사용하여 hematoxylin과 eosin으로 슬라이드를 얼룩 :
I. 크실렌 세척 3~5분 II. 크실렌 3~5분 III. 100 % 알코올 3~5분 IV. 100 % 알코올 3~5분 V. 95 % 알콜 3~5분 VI. 80 % 알콜 3~5분 VII. 물 세척 (몇 가지 변화) 이분 VIII. 길스 Hematoxylin # 3 2~5분 IX. 물 세척 (몇 가지 변화) 물이 맑은 실행까지 X. 스콧 물 (블루 핵까지) 삼분 이상 XI. 물 세척 (몇 가지 변화) 1~2분 XII. Eosin Y 일분 XIII. 물 세척 (몇 가지 변화) 30초 XIV. 80 % 알콜 일분 XV. 95 % 알콜 이분 XVI. 95 % 알콜 이분 XVII. 100 % 알코올 삼분 XVIII. 100 % 알코올 (청소) 삼분 XIX. 크실렌 이분 이상 XX. 크실렌 이분 이상 - Permount 각 슬라이드에 coverslip를 탑재합니다.
VI. 대표 결과
그림 1. culturing undifferentiated hESCs위한 피더 레이어 조사 CF1 마우스 배아 섬유아 세포의 도금. MEFs가 ~ 50 %의 합류에 도금 아르가 여기에 표시, 또는 6 자 문화 요리에 잘 3.5 ㎝ 직경 당 4 X 10 5 세포. 바, 100 μm의.
그림 2. MEF 피더 레이어에 undifferentiated hESCs의 subconfluent 문화 예. hESCs 그 다음 passaged으로 설명 여기 같이, ~ 70 %까지 합류 MEF 피더 레이어에 재배하고 있습니다. 바, 100 μm의.
그림 3. explanted 기형종의 예가. explantation 다음, 기형 종, 신장, 및 액세서리 조직은 포르말린에 블록으로 고정되어 있습니다 다음, 신장 및 액세서리 조직은 신중하게 파라핀에 삽입하기 전에 거리에 손질하고 있습니다.
그림 4. undifferentiated hESCs에서 파생된 기형종는 생체내의 세 세균 레이어의 조직의 대표가 포함되어 있습니다. 같은 그림 3에 묘사된 것과 기형 종은, 배아 조직을 식별하는 sectioned하고 hematoxylin 및 eosin 물들일했다. hESCs는 삼배 배아 레이어 (ectoderm (A, B), mesoderm (C), endoderm에서 파생된 조직을 일으키다 (D). (A) 초기 신경 튜브 구조. (B) 프리미티브 편평 상피. (C) 연골이 응축 mesenchyme의 캡슐로 둘러싸여. (D) 선의 장의 구조. 바, 100 μm의. 이미지가 저자의 허가 reprinted.
그림 5. 기형 종 분석은 태그, undifferentiated hESCs의 운명을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 이전에 게시된으로 (9), 태그가 지정되지 않은 hESCs과 함께 구체적으로 태그 hESCs의 혼합물이 기형 종의 형성 분석에 태그 세포의 운명을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 여기로 같이 표면 마커, CD133, 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 태그를 표현 undifferentiated hESCs은 태그가 지정되지 않은, undifferentiated hESCs과 함께 혼합했다. 이들은 신장 이식 캡슐의 기형종 형성하는 데 사용되었습니다. 안티 eGFP 항체와 hematoxylin 및 eosin - 스테인드 기형 종 섹션의 Immunohistochemical 분석 CD133 +의 hESCs의 neuroectodermal의 운명을 보여줍니다. 기형종는 그림 4와 같이 처리 및 조직 내에서 CD133 + GFP + 세포의 파생 상품을 집중하기 위해 안티 - eGFP 항체 (갈색)과 counterstained되었습니다. CD133 + 파생 세포 (화살표) 배아 ectoderm, 특별히 신경 상피 (왼쪽)와 초기 신경 튜브와 같은 구조 (오른쪽)에서 발생하는 조직에서 관찰되었다. 바, 100 μm의. 이미지가 저자의 허가 reprinted.
젤라틴
- 0.1 % 돼지의 젤라틴
- 99.9 % DPBS
- ° C (0.22μm) 1 시간 또는 모든 젤라틴이 솔루션으로 될 때까지, 그리고 필터는 소독 사용하기 전에 37 품어 DPBS에 젤라틴 추가합니다.
MEF 매체
- 10% 태아 소 혈청 (공인)
- 90 % Dulbecco는 (D - 멤) 필수 중간 수정된의
- 1X L - 글루타민
- 1X 펜 / Strep
- 사용하기 전에 소독을 필터링합니다.
KSR (마네 세럼 교환) 매체
- 20 % 마네 혈청 교환
- 80 % 마네 D - 멤
- 1X L - 글루타민
- 1X 불필요한 아미노산
- 0.1 MM β - 메르 캅 토 에탄올 /
- 12.5 NG / ML bFGF
- 소독 필터.
- 37 ° C,하지만 따뜻한 ° C 세포에 추가하기 전에 4 보관하십시오.
- 바로 사용하기 전에 bFGF를 추가합니다.
Collagenase IV
- 모든 가루는 솔루션으로 될 때까지 1-2시간 또는 37 ° C를 배치하여 KSR 매체 1 MG / ML을 디졸브.
- 소독 필터.
Avertin
- 0.25 g 2,2,2 - tribromoethanol
- 0.25 ML 2 - 메틸 - 2 - butanol
- 37 품어 ° C 100 % 솔루션을 형성 하룻밤.
- 수술 전에 몇 시간, 37 DPBS과 부화를 사용하여 희석하기 위해 2.5 % 작업 솔루션 ° 최소한 1 시간 동안 C.
- 소독 및 나누어지는 필터.
- Tribromoethanol 매우 가벼운 구분하므로 준비 및 사용의 모든 단계에서 빛으로부터 보호합니다.
- 사용하기 전에 더 이상 12-24 이상의 시간을 준비합니다.
Buprenorphine
- 메탄올 1 MG / ML 주식 솔루션
- 0.015 MG / 살균 H 2 O.을 사용 ML 작업 솔루션에 희석
- 최대 1 개월에 대해 -20 ° C에 보관하십시오.
케토프로펜
- DPBS 0.5 MG / ML 작업 솔루션
- , DPBS 추가 37 밤새 품어 ° C 1-2시간 또는 모든 가루가 솔루션으로 될 때까지.
- 소독 필터와 4 저장 ° C.
Discussion
우리는 생체내 환경에서 hESCs을 차별의 운명을 매핑하기위한 목적으로 고효율 기형 종 형성 분석을 적응있다. 특별히 선택된 hESCs의 소수가 undifferentiated 야생 유형 hESCs과 세포 펠렛을 형성 Phaseolus vulgaris의 렉틴와 혼합됩니다. 이것은 immunodeficient 마우스에서 신장 캡슐 아래 이식할 수 있습니다. 원래 선택한 hESCs의 운명은 다음 immunohistochemistry (그림 5)에 의해 결정 수로 이전 (9) 보도했다. 이 방법은 세포 기반 치료를위한 조직 특정 시약을 식별 및 생성을위한 유용한 도구를 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (RC1 - 00104), NHLBI에서 보건 서비스 그랜트 (HL085377)와 HSB로 Pollin 재단에서 선물에서 종합적인 연구 부여에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
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