Summary
Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar a
Abstract
Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm uma capacidade ilimitada de auto-renovação ea capacidade de se diferenciar em células derivadas de todos os três folhetos embrionários (1). Diferenciação dirigida de hESCs em tipos específicos de células tem gerado muito interesse no campo da medicina regenerativa (por exemplo, (2-5)), e métodos para determinar o
Protocol
O protocolo escrito abaixo é baseada em parâmetros publicados relatado pelos autores, com algumas modificações. O protocolo é realizada com a aprovação do Animal Care UCSF Institucional e Use (IACUC) e Supervisão Stem Cell Research (SCRO) Comités.
I. Cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs)
- HESCs crescer no padrão 6-bem (3,5 cm de diâmetro poços) placas.
- Pelo menos 12 horas antes da passaging células, fibroblastos de sementes embrionárias de rato (MEF; obtido a partir de camundongos CF1 dia e12.5 timed-acoplado, irradiados em 1000 Ci) alimentador de células em placas revestidas com gelatina 1% (6,7). MEFs deve ser banhado em 50-60 confluência%, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem (Figura 1).
- Células passagem quando colônias atingiram confluência ~ 70% (Figura 2).
- A passagem das células, o crescimento médio aspirar KSR (6) dos poços e substituir com 0,5 ml de meio contendo colagenase IV em KSR em uma concentração de 1 mg / ml.
- Incubar as placas com colagenase IV a 37 ° C / 5% CO 2 por 5 minutos ou até que as bordas de colônias começam a levantar a partir da placa.
- Remover colagenase IV da placa, adicionar 0,5 ml de KSR a cada poço, e manualmente raspar células para remover completamente a partir da placa.
- Recolher a suspensão de células de cada lugar, bem em um tubo de 15 ml cônico, e permitem que as células de resolver pela força da gravidade por 5 minutos.
- Remover o sobrenadante do tubo, deixando as células e médias empresas em um volume total de ~ 300 ul.
- Usando um conjunto de 200 micro-pipetador mL no volume máximo, gentilmente pipeta suspensão de células 5-6 vezes para acabar com as colônias.
- Traga a suspensão de célula para um volume total de 9 ml por poço original de células usando KSR médio (ou seja, se um bem é colhida, o tubo deve conter 9 ml). Suplementar o meio com recombinante fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (bFGF) a uma concentração de 12,5 ng / ml.
- Depois de lavar a novos poços contendo células MEF (consulte a etapa 2) com fosfato de Dulbecco solução salina tamponada (DPBS) para remover todos os soro, adicionar 3 ml de suspensão de células para cada poço e incubar as placas a 37 ° CO C / 5% 2.
- Alterar médio KSR com bFGF 24 horas após a passagem, e cada 24-48 horas até que as células estão prontas para serem várias passagens novamente.
II. Preparação de CTEh pellet para enxertia
- Menos 24 horas antes de enxertia, adicione inibidor ROCHA ao meio KSR para uma concentração final de 10μM de aumentar a viabilidade celular (8). Um poço de células em confluência ~ 70% (5 x 10 5 células) vai criar dois pellets, com dois pellets inserido por cápsula renal.
- Para preparar pellets de células para enxertia (9), incubar a ROCHA inibidor tratados com culturas com colagenase IV por 5 minutos a 37 ° CO C / 5% 2.
- Aspirar o IV colagenase do poço e substituir por um DPBS ml com 10% de penicilina / estreptomicina (pen / strep).
- Manualmente raspar as colônias da placa, lavar bem com um adicional de 1 ml DPBS com caneta / strep, e transferência de cada alíquota de 1ml de suspensão celular para um microtubo de 1,5 ml.
- Girar tubos de microcentrífuga brevemente a 8.000 x g, aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em DPBS 500μl com caneta / strep.
- Para ajudar a vincular a células juntas para transplante, adicionar 100μl 1 mg / ml de lectina de Phaseolus vulgaris (PHA) em DPBS a cada tubo.
- Incubar a célula / suspensão PHA em temperatura ambiente por 5 minutos, em seguida, girar durante 2 minutos a 8.000 x g. Girar os tubos de 180 ° dentro de seus poços de rotor e girar novamente por 2 minutos a 8.000 x g.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando o pellet intacta.
- Desalojar os pellets de células dos tubos com cuidado pipetando KSR 200μl junto à borda da pelota até que lentamente se levanta.
- Uma vez deslocada, transferir imediatamente as pelotas de 0.4μm insere MILLICELL colocados em poços 3,5 cm de diâmetro contendo 3 ml KSR, e incubar por 2 horas durante a noite a 37 ° C / 5% CO 2.
III. Cápsula renal enxertia
- Executar todos os procedimentos animal, em conformidade com as diretrizes institucionais, utilizando técnica asséptica apropriada.
- Anestesiar ratos SCID bege (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / Crl), com idades entre 8-12 semanas, usando uma combinação de O2 inalado 3% isoflurane/0.5% e tribromoetanol intraperitoneal (Avertin; 25 mg / kg preparada na hora). Dois pellets por célula do rato será enxertada usando técnicas descritas (10).
- Depois de colocar o mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, raspar a área da incisão, em seguida, desinfectá-la com clorexidina. Faça uma incisão de 2,5 cm através da pele apenas fora do centro, mas paralelo à coluna vertebral.
- Mantendo a área úmida incisão com salin estérile, fazer uma pequena incisão através do músculo, logo abaixo das costelas e ~ 1 cm da coluna vertebral. A incisão deve ser grande o suficiente para puxar o rim através, mas pequeno o suficiente para que o rim não vai escorregar de volta para dentro da cavidade abdominal sem força.
- Puxe delicadamente o rim através da incisão do músculo através de um vidro Pasteur pipeta que tem sido puxado para dentro da forma de um gancho, sem corte ligeiramente curvada.
- Molhar o rim com DPBS estéril para evitar a cápsula de secar. Isto pode ser necessário repetir todo o procedimento, como a cápsula é muito frágil.
- Utilizando uma pinça Dumont # 5, puxe a cápsula a partir do rim e fazer uma incisão 2 milímetros usando uma tesoura primavera Vannas.
- Com outra pipeta de vidro que foi colocado em uma sonda muito fina, embotado, faça uma pequena bolsa entre a cápsula eo rim.
- Usando uma ponteira de grande orifício colocado em uma pipeta de transferência descartável, tomar uma única célula pellet a partir da inserção MILLICELL. Certifique-se de ter tão pouco de mídia extra junto possível, como a mídia em excesso pode interferir com a transferência da pelota.
- Segurando na borda da incisão para criar o bolso, coloque delicadamente o sedimento ao lado da abertura e empurre-o no bolso em direção a um pólo do rim com a pipeta puxado.
- Repita o processo com uma pelota segundo. Coloque este sob a cápsula do rim mesmo, mas em direção ao pólo oposto.
- Cuidadosamente coloque a cápsula de volta para a pellets. As pelotas deve ficar dentro do bolso, e sem suturas são necessárias para fechar a cápsula.
- Com cuidado, empurre o rim de volta para a cavidade abdominal e fechar a parede muscular utilizando fio de seda 4-0 (ou menor) com agulha de corte reverso ligado. A incisão deve ser pequeno o suficiente para que apenas uma única sutura é necessário.
- Feche a pele com uma série de 4-5 pontos interrompidos, utilizando o mesmo material de sutura.
- Antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola, administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (11,12) e 5 mg / kg de cetoprofeno (12,13) como analgésicos de curto prazo e longo prazo, respectivamente. Substâncias controladas só deve ser utilizado de acordo com as diretrizes institucionais.
- Transferir os animais de volta para sua gaiola e permitir que ele se recupera da anestesia em uma almofada de aquecimento. Isso deve levar cerca de 20-30 minutos.
- Uma vez que o mouse é totalmente ambulatorial, ele pode ser devolvido para a instalação de habitação animal.
IV. Colheita teratoma fixação, e secção
- Em 8-12 semanas após a cirurgia, deve haver um teratoma quase palpável perto do rim. Grande, cheio de líquido cistos, muitas vezes, desenvolver, bem como, a partir de 6-8 semanas. Estes podem necessitar de uma colheita mais cedo, se eles causam sofrimento ao animal. Desde teratomas crescer a taxas mais lentas do que cistos, no entanto, você vai querer esperar tanto tempo quanto possível para obter um teratoma de tamanho suficiente para a análise (ou seja, pelo menos 8 semanas).
- Remover o rim, teratoma, e qualquer cistos em torno de um bloco de tecido da cavidade abdominal utilizando a mesma abordagem cirúrgica pela qual o rim foi originalmente acessado (consulte a Seção III, os passos 1-4 acima).
- Coloque todo o bloco de tecido excisado em um tubo contendo formol tamponado 10%.
- Permitir que o teratoma para corrigir durante a noite a 4 ° C.
- No dia seguinte, retire o teratoma do tubo. Dissecar fora qualquer cistos nos rins e, tanto quanto possível sem danificar o teratoma si (Figura 3). Teratomas maiores podem ser cortados ao meio para facilitar a dissecção e incorporação.
- O processo de teratoma usando uma técnica de fixação de parafina padrão. Unidades automáticos estão disponíveis (por exemplo, hipercentro Shandon):
I. 80% de álcool Flex 2 horas II. 80% de álcool Flex Uma hora III. 85% de álcool Flex 1,5 horas IV. 95% de álcool Flex Uma hora V. 100% de álcool Flex Uma hora VI. 100% de álcool Flex Uma hora VII. 100% de álcool Flex Uma hora VIII. Clear-Rite 3 Uma hora IX. Clear-Rite 3 Uma hora X. Clear-Rite 3 Uma hora XI. Parafina (TissuePrep) 2 horas XII. Parafina (TissuePrep) 2 horas
V. Imunohistoquímica e análise
- Uma vez incorporado na seção de parafina, o teratoma em 5m cortes seriados usando um micrótomo rotativo, e as seções flutuam em slides.
- Antes de coloração, cozer os slides por pelo menos uma hora.
- Mancha as lâminas com hematoxilina e eosina usando métodos padrão para identificar estruturas de tecidos representante de cada um dos três folhetos embrionários (Figura 4):
I. Lavagem de xileno 3-5 minutos II. Xileno 3-5 minutos III. Álcool 100% 3-5 minutos IV. Álcool 100% 3-5 minutos V. Álcool a 95% 3-5 minutos VI. 80% de álcool 3-5 minutos VII. Lavagem com água (diversas alterações) 2 minutos VIII. Hematoxilina de Gill # 3 2-5 minutos IX. Lavagem com água (diversas alterações) até que a água corre claro X. Água Scott (para núcleos azul) 3 minutos ou mais XI. Lavagem com água (diversas alterações) 1-2 minutos XII. Eosina Y Um minuto XIII. Lavagem com água (diversas alterações) 30 segundo XIV. 80% de álcool Um minuto XV. Álcool a 95% 2 minutos XVI. Álcool a 95% 2 minutos XVII. Álcool 100% 3 minutos XVIII. 100% de álcool (limpo) 3 minutos XIX. Xileno 2 minutos ou mais XX. Xileno 2 minutos ou mais - Montar uma lamela em cada slide com Permount.
VI. Resultados representante
Figura 1. Chapeamento de fibroblastos irradiados CF1 embrionárias de rato como uma camada de alimentação para hESCs cultura indiferenciada. MEFs são banhados em ~ confluência de 50%, como mostrado aqui, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem em uma placa de cultura de 6 bem. Bar, 100 mm.
Figura 2. HESCs exemplo da cultura confluentes de hESCs indiferenciados em uma camada de alimentação MEF. São cultivadas em camadas alimentador MEF até confluentes ~ 70%, como mostrado aqui, então várias passagens como descrito. Bar, 100 mm.
Figura 3. Exemplo de teratomas explantado. Seguindo explante, o teratoma, rim e qualquer tecido acessório são fixos como um bloco em formalina, em seguida, o rim e tecido acessório são cuidadosamente aparado antes de inclusão em parafina.
Figura 4. Teratomas derivado hESCs indiferenciada conter tecidos representativos de todos os três camadas germinativas in vivo. Um teratoma, como um representado na Figura 3, foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina para identificar tecidos embrionários. hESCs dar origem a tecidos derivados dos três folhetos embrionários (ectoderma (A, B), mesoderma (C), endoderme (D). (A) estrutura do tubo neural Nascente. (B) epitélio escamoso primitivo. (C) Cartilagem rodeado por cápsula de mesênquima condensado. (D) estrutura glandular intestinal. Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor.
Figura 5. Análise teratoma pode ser usado para mapear o destino do tag, hESCs indiferenciada. Como já publicados (9), uma mistura de hESCs especificamente marcados com hESCs untagged pode ser usado para mapear o destino das células marcado em um ensaio de formação de teratomas. Como mostrado aqui, hESCs indiferenciada expressando o marcador de superfície, CD133, e marcou com a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), foram misturados com untagged, hESCs indiferenciada. Estes foram usados para formar teratomas pela cápsula renal enxertia. Análise imunohistoquímica de hematoxilina e eosina seções manchadas de teratoma com anticorpo anti-eGFP demonstra o destino neuroectodérmico da CD133 hESCs +. Teratomas foram processados como na Figura 4 e contrastado com anticorpo anti-eGFP (marrom) para localizar os derivados de células CD133 + + GFP dentro dos tecidos. CD133 + células derivadas (setas) foram observadas nos tecidos decorrentes da ectoderma embrionário, especificamente epitélio neural (esquerda) e nascente do tubo neural estruturas semelhantes (à direita). Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor.
Gelatina
- 0,1% de gelatina Porcina
- DPBS 99,9%
- Adicione a gelatina para DPBS, incubar a 37 ° C por uma hora ou até que todos gelatina entra em solução, e filtro de esterilizar (0.22μm) antes do uso.
MEF médio
- 10% de soro fetal bovino (Qualificado)
- Dulbecco 90% do Modified Meio Essencial (D-MEM)
- 1x L-Glutamina
- 1x Pen / Strep
- Filtro de esterilizar antes do uso.
KSR médio (substituição Knockout Serum)
- Substituição de soro de 20% KnockOut
- 80% KnockOut D-MEM
- 1x L-Glutamina
- 1x aminoácidos não essenciais
- 0,1 mM β-mercaptoetanol /
- 12,5 ng / ml bFGF
- Filtro de esterilizar.
- Armazenar a 4 ° C, mas quente a 37 ° C antes de adicionar às células.
- Adicionar bFGF imediatamente antes da utilização.
Colagenase IV
- Dissolver 1 mg / ml em meio KSR, colocando a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução.
- Filtro de esterilizar.
Avertin
- 0,25 g 2,2,2-tribromoetanol
- 0,25 ml 2-metil-2-butanol
- Incubar a 37 ° C durante a noite para formar uma solução 100%.
- Várias horas antes da cirurgia, diluir a 2,5% solução de trabalho usando DPBS e incubar a 37 ° C durante pelo menos 1 hora.
- Filtro de esterilizar e alíquota.
- Tribromoetanol é altamente sensível à luz, de modo a proteger da luz em todas as fases de preparação e uso.
- Prepare não mais de 12-24 horas antes de usar.
Buprenorfina
- 1 mg / ml solução estoque em metanol
- Diluir a 0,015 mg / ml solução estéril de trabalho usando H 2 O.
- Armazenar a -20 ° C por até 1 mês.
Cetoprofeno
- 0,5 mg / ml solução de trabalho na DPBS
- Adicionar DPBS, incubar overnight a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução.
- Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
Discussion
Nós adaptamos um ensaio de formação altamente eficiente teratoma com a finalidade de mapear o destino de diferenciar hESCs em um ambiente em vivo. Um pequeno número de hESCs especificamente selecionados é misturado com indiferenciada hESCs tipo selvagem e lectina Phaseolus vulgaris para formar um pellet de células. Este é enxertada embaixo da cápsula renal em um mouse imunodeficientes. O destino do hESCs originalmente selecionado pode então ser determinada por imuno-histoquímica (Figura 5), conforme relatado anteriormente (9). Este método fornece uma valiosa ferramenta para identificar e gerar tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa abrangente do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RC1-00104), um Serviço de Saúde Pública Grant (HL085377) de NHLBI, e um presente da Fundação Pollin para HSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486 | Avertin |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin |
| 4-0 silk sutures | Ethicon Inc. | 641G | |
| bFGF | R&D Systems | 233FB | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B7536 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046-341 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D-MEM | Invitrogen | 11965 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Dupont #5 forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500233 | Kidney capsule |
| Eosin Y | Fisher Scientific | 23-245-658 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified) | Invitrogen | 26140-079 | |
| Flex alcohol | Fisher Scientific | 22-046344 | |
| Gill’s Hematoxylin #3 | Fisher Scientific | 22-050-204 | |
| Hemostat, straight | World Precision Instruments, Inc. | 501241 | General surgery |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | General surgery |
| Ketoprofen | Sigma-Aldrich | K2012 | |
| KnockOut D-MEM | Invitrogen | 10829 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25020-081 | |
| MILLICELL inserts | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Nonessential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| Operating scissors | World Precision Instruments, Inc. | 501754 | General surgery |
| Paraffin (TissuePrep) | Fisher Scientific | 8002-74-02 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| PHA | Sigma-Aldrich | L1668 | |
| Porcine gelatin | Sigma-Aldrich | G6144 | |
| ROCK inhibitor | Calbiochem | Y-27632 | |
| SCID beige mice | Charles River Laboratories | 250 | |
| Scott’s Wash | Fisher Scientific | 6697-32 | Ricca Chemicals |
| Vannas spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | Kidney capsule |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 |
References
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases. J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).
- Safinia, N., Minger, S. L. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).
- Nury, D., Neri, T., Puceat, M. Human embryonic stem cells and cardiac cell fate. J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
- Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. Culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 2, 455-463 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures. Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).
- Cunha, G. R. Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation. Anat Rec. 172, 179-195 (1972).
- Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion. Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).
- Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).
- Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen. Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).
