टेराटोमा संरचना द्वारा मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की किस्मत मानचित्रण

Summary

विशिष्ट कोशिकाओं में hESCs के निर्देशित भेदभाव पुनर्योजी चिकित्सा में काफी रुचि उत्पन्न की है. हम एक संक्षिप्त, निर्धारित करने के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान<em> Vivo में</emचयनित hESCs कि सेल आधारित चिकित्सा के लिए ऊतक विशेष अभिकर्मकों निस्र्पक के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है> भाग्य.

Abstract

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) आत्म नवीकरण के लिए एक असीमित क्षमता है, और सभी तीन भ्रूण रोगाणु परत (1) से ली गई कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता है. विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में hESCs के निर्देशित भेदभाव पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र (जैसे, (2-5)) में ज्यादा रुचि उत्पन्न किया है, और निर्धारित करने के लिए तरीके<em> Vivo में</em> चयनित या चालाकी hESCs के भाग्य इस प्रयास के लिए आवश्यक हैं. हम इस उद्देश्य के लिए एक अत्यधिक कुशल teratoma गठन परख अनुकूल है. विशेष रूप से चयनित hESCs की एक छोटी संख्या undifferentiated जंगली प्रकार hESCs और Phaseolus vulgaris लेक्टिन के लिए एक सेल गोली फार्म के साथ मिलाया जाता है. यह एक immunodeficient माउस में गुर्दे कैप्सूल के नीचे grafted है. के रूप में 2.5 x 10 के रूप में कुछ⁵ HESCs के लिए एक 16 सेमी के रूप में की जरूरत है³ Teratoma 8-12 हफ्तों के भीतर. मूल रूप से चयनित hESCs के भाग्य तो immunohistochemistry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस विधि सेल आधारित चिकित्सा के लिए ऊतक विशेष अभिकर्मकों निस्र्पक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण उपलब्ध कराता है.

Protocol

लिखित नीचे प्रोटोकॉल लेखकों द्वारा कुछ संशोधनों के साथ, रिपोर्ट प्रकाशित मानकों पर आधारित है. प्रोटोकॉल UCSF संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग करें (IACUC) और स्टेम सेल रिसर्च (SCRO) निगरानी समितियों द्वारा अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया है. मैं संस्कृति मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) 6 अच्छी तरह प्लेटें (3.5 सेमी व्यास कुओं) मानक में hESCs हो जाओ. कम से कम 12 घंटे पहले passaging, बीज माउस भ्रूणीय (MEF; CF1 दिन से e12.5 समय mated चूहों, 1000 Ci पर विकिरणित प्राप्त) fibroblast कोशिकाओं प्लेटें पर फीडर कोशिकाओं 1% जिलेटिन (6,7) के साथ लेपित. MEFs 50-60% संगम, या 4 पर चढ़ाया होना चाहिए x 3.5 सेमी व्यास अच्छी तरह से 5 प्रति 10 कोशिकाओं (चित्रा 1). पारित होने कोशिकाओं जब कालोनियों ~ 70% संगम (चित्रा 2) तक पहुँच चुके हैं. पारित होने के लिए कोशिकाओं, aspirate कुओं से KSR विकास (6) मध्यम और 0.5 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में KSR में Collagenase चतुर्थ युक्त मध्यम के साथ की जगह. 37 Collagenase चतुर्थ के साथ प्लेटें सेते ° सी / 5% 5 मिनट के लिए या कालोनियों के किनारों तक सीओ 2 थाली से उठा शुरू . निकालें थाली से Collagenase चतुर्थ, KSR के 0.5 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए, और मैन्युअल कोशिकाओं परिमार्जन करने के लिए पूरी तरह से थाली से दूर. प्रत्येक अच्छी तरह से जगह, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में से कक्ष निलंबन लीजिए, और कोशिकाओं को गंभीरता से 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें 300μl ~ की कुल मात्रा में कोशिकाओं और मध्यम छोड़ने. पूर्ण मात्रा में एक 200 μl सूक्ष्म pipettor सेट का प्रयोग, धीरे सेल निलंबन 5-6 बार विंदुक कालोनियों तोड़ने. KSR मध्यम (यानी, अगर एक अच्छी तरह से काटा जाता है, ट्यूब 9 मिलीलीटर शामिल करना चाहिए) का उपयोग कर कक्षों की मूल अच्छी तरह से प्रति 9 मिलीलीटर की कुल मात्रा सेल निलंबन लाओ. पुनः संयोजक मानव बुनियादी fibroblast वृद्धि 12.5 एनजी / एमएल के एक एकाग्रता के कारक (bFGF) के साथ मध्यम अनुपूरक. नए कुओं Dulbecco फॉस्फेट के साथ MEF कोशिकाओं (चरण 2 देखें) से युक्त धोने के बाद खारा buffered (DPBS) सभी सीरम निकालने के लिए, एक अच्छी तरह सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर जोड़ने और 37 ° सी / 5% सीओ 2 प्लेटों को सेते हैं. BFGF पारित होने के बाद 24 घंटे, और हर 24-48 घंटे के साथ KSR मध्यम बदलें जब तक कोशिकाओं को फिर से passaged होने के लिए तैयार हैं. द्वितीय. HESC गोली की कलम बांधने का काम के लिए तैयार कलम बांधने का काम से पहले 24 घंटे में, KSR माध्यम से 10μM के अंतिम एकाग्रता के लिए रॉक अवरोध करनेवाला के लिए सेल व्यवहार्यता (8) में वृद्धि जोड़ने. एक ~ 70% संगम (5 x 10 5 कोशिकाओं) में कोशिकाओं के दो छर्रों दो गुर्दे कैप्सूल प्रति सम्मिलित छर्रों के साथ पैदा करेगा . सेल छर्रों (9) कलम बांधने का काम करने के लिए तैयार करने के लिए, 37 पर 5 मिनट के लिए Collagenase चतुर्थ के साथ रॉक अवरोध करनेवाला का इलाज संस्कृतियों सेते ° सी / 5% सीओ 2. अच्छी तरह से Collagenase चतुर्थ Aspirate और 1 मिलीलीटर DPBS के साथ 10% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep /) के साथ की जगह. थाली से मैन्युअली कालोनियों परिमार्जन करने के लिए, पेन / strep के साथ एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर DPBS के साथ अच्छी तरह कुल्ला, और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब सेल निलंबन के प्रत्येक 1ml विभाज्य हस्तांतरण. Microfuge ट्यूबों ८००० एक्स ग्राम पर संक्षेप में स्पिन, aspirate सतह पर तैरनेवाला, और कलम / strep साथ 500μl DPBS में छर्रों resuspend. मदद करने के लिए कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक साथ बाँध के लिए, प्रत्येक ट्यूब 100μl 1 मिलीग्राम / एमएल DPBS में Phaseolus vulgaris लेक्टिन (पीएचए) जोड़ें. 5 मिनट के लिए सेल / कमरे के तापमान पर पीएचए निलंबन सेते हैं, तो 8000 x जी पर 2 मिनट के लिए स्पिन. उनके रोटर कुओं के भीतर 180 ° ट्यूबों घुमाएँ और ८,००० एक्स जी पर 2 मिनट के लिए फिर से स्पिन. ध्यान से गोली बरकरार छोड़ने सतह पर तैरनेवाला aspirate. धीरे 200μl गोली के किनारे करने के लिए अगले KSR pipetting जब तक यह धीरे धीरे लिफ्टों द्वारा ट्यूबों सेल छर्रों से बेदखल. एक बार उखाड़ फेंकना है, तुरंत 0.4μm MILLICELL 3.5 सेमी व्यास 3 मिलीलीटर KSR युक्त कुओं में रखा आवेषण छर्रों हस्तांतरण, और रात भर के लिए 2 घंटे के लिए 37% / 5 सी ° सीओ 2 सेते हैं. III. गुर्दे कलम बांधने का काम कैप्सूल संस्थागत उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग दिशा निर्देशों के अनुसार में सभी पशु प्रक्रियाओं प्रदर्शन करना. SCID बेज चूहों (CB17.Cg Prkdc SCID Lyst bg / CRL), 8-12 सप्ताह आयु वर्ग, साँस 3% isoflurane/0.5% O2 और intraperitoneal tribromoethanol (Avertin, 25 मिलीग्राम / हौसले से तैयार किलो) का एक संयोजन का उपयोग कर anesthetize. माउस प्रति दो सेल छर्रों तकनीक वर्णित (10) का उपयोग कर engrafted जाएगा. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक हीटिंग पैड पर माउस रखने के बाद, चीरा क्षेत्र दाढ़ी, तो यह chlorhexidine साथ कीटाणुरहित. सिर्फ केंद्र बंद त्वचा लेकिन रीढ़ की हड्डी में समानांतर के माध्यम से एक 2.5 सेमी चीरा बनाओ. बाँझ सलिन के साथ चीरा क्षेत्र नम रखते हुएई, पसलियों और रीढ़ की हड्डी से ~ 1 सेमी नीचे सिर्फ मांसपेशियों के माध्यम से एक छोटे चीरा,. चीरा अभी काफी बड़े के माध्यम से गुर्दे खींच, लेकिन काफी छोटा है कि गुर्दा बल के बिना वापस उदर गुहा में नहीं होगा पर्ची होना चाहिए. मांसपेशियों का उपयोग कर एक गिलास पाश्चर विंदुक कि एक कुंद, थोड़ा वक्रित हुक के आकार में खींच लिया है चीरा के माध्यम से गुर्दे धीरे खींचो. गीले बाँझ DPBS के साथ गुर्दे के बाहर सुखाने से कैप्सूल रोकने के. यह प्रक्रिया भर में दोहराने के लिए, के रूप में कैप्सूल बहुत नाजुक है आवश्यक हो सकता है है. Dumont # 5 संदंश का प्रयोग, धीरे कैप्सूल खींच और गुर्दे से 2 मिमी चीरा Vannas वसंत कैंची का उपयोग करना. एक गिलास विंदुक है कि एक बहुत ही सुन्दर है, पा जांच में खींच लिया है के साथ, कैप्सूल और गुर्दे के बीच एक छोटी सी जेब बनाते हैं. बड़े छिद्र विंदुक एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक पर रखा टिप का उपयोग करना, MILLICELL डालने से किसी एकल कक्ष गोली ले. थोड़ा अतिरिक्त मीडिया के रूप में संभव के रूप में साथ ले, के रूप में अतिरिक्त मीडिया गोली हस्तांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं सुनिश्चित करें. समय जेब बनाने चीरा के किनारे पकड़, धीरे गोली खोलने के लिए बगल में जगह है और यह एक ध्रुव की ओर खींच विंदुक के साथ गुर्दे की जेब में धक्का. एक दूसरी गोली के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ. एक ही गुर्दे के कैप्सूल के तहत इस प्लेस, लेकिन विपरीत ध्रुव की ओर. ध्यान से छर्रों पर कैप्सूल वापस नीचे जगह है. छर्रों जेब के भीतर रहने चाहिए, और कोई sutures के कैप्सूल बंद करने के लिए आवश्यक हैं. धीरे वापस गुर्दे और उदर गुहा में मांसपेशियों संलग्न सुई रिवर्स काटने के साथ 4-0 रेशम sutures के (या छोटे) का उपयोग कर दीवार बंद धक्का. चीरा काफी छोटा है कि केवल एक ही सिवनी आवश्यक है होना चाहिए. 4-5 बाधित टाँके की एक श्रृंखला के साथ त्वचा को बंद करें, वही सिवनी सामग्री का उपयोग. माउस वापस अपने पिंजरे में रखने से पहले, अल्पकालिक और दीर्घकालिक दर्दनाशक दवाओं के रूप में 0.05 मिलीग्राम / किग्रा (11,12) buprenorphine और 5 मिलीग्राम / किग्रा ketoprofen (12,13) ​​का प्रशासन क्रमशः. नियंत्रित पदार्थों केवल संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए. पशु वापस अपने पिंजरे के लिए और हस्तांतरण यह एक हीटिंग पैड पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देते हैं. यह 20-30 मिनट के बारे में लेना चाहिए. एक बार पूरी तरह से चल माउस है, यह जानवर आवास की सुविधा के लिए लौट जा सकता है. चतुर्थ. टेराटोमा फसल निर्धारण, और सेक्शनिंग 8-12 सप्ताह के बाद सर्जरी में, वहाँ गुर्दे के पास एक मात्र स्पर्शनीय teratoma होना चाहिए. बड़े, तरल पदार्थ से भरे अल्सर अक्सर के रूप में अच्छी तरह से विकसित, 6-8 सप्ताह में शुरू. ये एक पहले फसल की जरूरत है अगर वे जानवर के लिए संकट का कारण हो सकता है. चूंकि teratomas अल्सर की तुलना में धीमी दर पर बढ़ने के लिए, तथापि, आप के रूप में संभव के रूप में लंबे समय तक प्रतीक्षा करने के लिए विश्लेषण (यानी, कम से कम 8 सप्ताह) के लिए पर्याप्त आकार का एक teratoma प्राप्त करना चाहते हैं जाएगा. गुर्दे, teratoma, और उदर गुहा का उपयोग कर एक ही शल्य दृष्टिकोण है जिसके द्वारा गुर्दे मूल रूप से पहुँचा था से ऊतक के एक ब्लॉक के रूप में किसी भी आसपास के अल्सर निकालें (देखें धारा III, 1-4) ऊपर कदम. एक युक्त 10% formalin buffered ट्यूब में excised ऊतक के पूरे ब्लॉक रखें. Teratoma रात 4 में ठीक करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस अगले दिन, ट्यूब से teratoma हटा दें. दूर teratoma ही (चित्रा 3) को नुकसान पहुँचाए बिना संभव के रूप में किसी और के रूप में ज्यादा गुर्दा अल्सर काटना. बड़ा teratomas आधे में कटौती हो सकता है विच्छेदन और एम्बेडिंग की सुविधा. एक मानक तकनीक आयल – निर्धारण का उपयोग teratoma प्रक्रिया. स्वचालित इकाइयों उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए, Shandon Hypercenter ): मैं 80% फ्लेक्स शराब 2 घंटे द्वितीय. 80% फ्लेक्स शराब 1 घंटे III. 85% फ्लेक्स शराब 1.5 घंटे चतुर्थ. 95% फ्लेक्स शराब 1 घंटे वी. 100% फ्लेक्स शराब 1 घंटे छठी. 100% फ्लेक्स शराब 1 घंटे सातवीं. 100% फ्लेक्स शराब 1 घंटे आठवीं. 3 साफ – अनुष्ठान 1 घंटे ग्यारहवीं. 3 साफ – अनुष्ठान 1 घंटे एक्स 3 साफ – अनुष्ठान 1 घंटे </p> ग्यारहवीं. आयल (TissuePrep) 2 घंटे बारहवीं. आयल (TissuePrep) 2 घंटे वी. immunohistochemistry और विश्लेषण एक बार आयल, 5μm धारावाहिक एक रोटरी सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग स्लाइस में teratoma अनुभाग, स्लाइड्स पर और नाव वर्गों में एम्बेडेड. धुंधला हो जाना से पहले, कम से कम एक घंटे के लिए स्लाइड्स सेंकना. मानक तरीकों का उपयोग करने के लिए तीन भ्रूण रोगाणु परतें (चित्रा 4) में से प्रत्येक के प्रतिनिधि ऊतक संरचनाओं की पहचान hematoxylin और eosin के साथ स्लाइड्स दाग : मैं Xylene धोने 3-5 मिनट द्वितीय. Xylene 3-5 मिनट III. 100% शराब 3-5 मिनट चतुर्थ. 100% शराब 3-5 मिनट वी. 95% शराब 3-5 मिनट छठी. 80% शराब 3-5 मिनट सातवीं. जल धोने (कई बदलावों) 2 मिनट आठवीं. गिल Hematoxylin # 3 2-5 मिनट ग्यारहवीं. जल धोने (कई बदलावों) जब तक पानी साफ चलाता है एक्स स्कॉट पानी (नीले नाभिक) 3 मिनट या उससे अधिक ग्यारहवीं. जल धोने (कई बदलावों) 1-2 मिनट बारहवीं. Eosin वाई 1 मिनट तेरहवीं. जल धोने (कई बदलावों) 30 सेकंड XIV. 80% शराब 1 मिनट XV. 95% शराब 2 मिनट XVI. 95% शराब 2 मिनट XVII. 100% शराब 3 मिनट XVIII. 100% शराब (स्वच्छ) 3 मिनट XIX. Xylene 2 मिनट या अधिक XX. Xylene 2 मिनट या अधिक Permount के साथ प्रत्येक स्लाइड पर एक coverslip माउंट. छठी. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1. विकिरणित CF1 संवर्धन undifferentiated hESCs के लिए एक फीडर परत के रूप में माउस भ्रूणीय fibroblasts के चढ़ाना MEFs ~ 50% संगम पर चढ़ाया, जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, या 4 x 3.5 6 अच्छी तरह से एक संस्कृति डिश में अच्छी तरह सेमी व्यास 5 प्रति 10 कोशिकाओं. शराबख़ाना, 100 सुक्ष्ममापी. चित्रा 2. एक MEF फीडर परत पर undifferentiated hESCs के subconfluent संस्कृति का उदाहरण hESCs MEF 70 ~% मिला हुआ तक फीडर परतों पर बड़े हो रहे हैं, जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, तो के रूप में वर्णित passaged. शराबख़ाना, 100 सुक्ष्ममापी. चित्रा 3. Explanted teratomas का उदाहरण explantation के बाद, teratoma, गुर्दे, और किसी भी गौण ऊतक formalin में एक ब्लॉक के रूप में तय कर रहे हैं, तो गुर्दे और गौण ऊतक ध्यान आयल में एम्बेड पहले दूर छंटनी. चित्रा 4. Undifferentiated hESCs से व्युत्पन्न teratomas vivo में सभी तीन रोगाणु परतें के ऊतकों के प्रतिनिधि होते हैं जैसे एक 3 चित्र में चित्रित teratoma, sectioned और hematoxylin और eosin साथ दाग भ्रूण ऊतकों की पहचान थी.. hESCs सभी तीन भ्रूण रोगाणु परतें ((ए, बी) बाह्य त्वक स्तर, mesoderm (सी), endoderm से व्युत्पन्न ऊतकों को जन्म दे (डी). (ए) नवजात न्यूरल ट्यूब संरचना. (ख) आदिम स्क्वैमस उपकला. (सी) उपास्थि गाढ़ा mesenchyme के कैप्सूल से घिरा हुआ है. (डी) ग्रंथियों आंतों संरचना. शराबख़ाना, 100 सुक्ष्ममापी. लेखक की अनुमति के साथ reprinted छवियाँ. चित्रा 5. टेराटोमा विश्लेषण करने के लिए टैग, undifferentiated hESCs के भाग्य का नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है जैसा कि पहले प्रकाशित (9), untagged hESCs के साथ विशेष रूप से टैग hESCs का एक मिश्रण एक teratoma गठन परख में टैग कोशिकाओं के भाग्य का नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसा कि यहाँ दिखाया, undifferentiated सतह मार्कर, CD133, और बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के साथ टैग व्यक्त hESCs, untagged, undifferentiated hESCs के साथ मिलाया गया. इन गुर्दे की कलम बांधने का काम कैप्सूल द्वारा teratomas फार्म इस्तेमाल किया गया. विरोधी EGFP एंटीबॉडी के साथ hematoxylin और eosin दाग teratoma वर्गों के immunohistochemical विश्लेषण CD133 + hESCs के neuroectodermal भाग्य को दर्शाता है. Teratomas के रूप में चित्रा 4 में प्रोसेस किया गया और विरोधी EGFP एंटीबॉडी (भूरे रंग का) के साथ counterstained ऊतकों के भीतर CD133 + GFP + कोशिकाओं के डेरिवेटिव स्थानीयकरण है. CD133 + व्युत्पन्न कोशिकाओं (तीर) भ्रूण बाह्य त्वक स्तर, विशेष रूप से तंत्रिका उपकला (बाएं) और नवजात न्यूरल ट्यूब संरचनाओं की तरह (दाएं) से उत्पन्न होने वाले ऊतकों में मनाया गया. शराबख़ाना, 100 सुक्ष्ममापी. लेखक की अनुमति के साथ reprinted छवियाँ. जेलाटीन 0.1% सुअर जिलेटिन 99.9% DPBS DPBS, 37 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने से पहले एक घंटे के लिए या जब तक सभी जिलेटिन समाधान में चला जाता है, और फिल्टर बाँझ (0.22μm) सेते जिलेटिन जोड़ें. MEF मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (अर्हताप्राप्त) 90% Dulbecco आवश्यक मध्यम संशोधित (डी सदस्य) एल Glutamine 1x 1x पेन / Strep फ़िल्टर उपयोग करने से पहले बाँझ. KSR मध्यम (नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट) 20% पीटा सीरम रिप्लेसमेंट 80% पीटा डी सदस्य एल Glutamine 1x 1x nonessential एमिनो एसिड 0.1 मिमी β-mercaptoethanol / 12.5 एनजी / मिलीलीटर bFGF बाँझ फ़िल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस, लेकिन 37 के लिए गर्म ° कोशिकाओं को जोड़ने से पहले सी स्टोर. तुरंत का उपयोग करने से पहले bFGF जोड़ें. Collagenase चतुर्थ 37 में 1-2 घंटे या के लिए डिग्री सेल्सियस रखने जब तक सभी पाउडर समाधान में चला जाता है 1 / KSR मध्यम मिलीग्राम मिलीलीटर में भंग. बाँझ फ़िल्टर. Avertin 0.25 2,2,2 tribromoethanol जी 0.25 2 – मिथाइल-2-butanol मिलीलीटर 37 में सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 100% समाधान के रूप में रातोंरात. सर्जरी से पहले कई घंटे, पतला करने के लिए 2.5% काम 37 पर DPBS और सेते का उपयोग समाधान ° सी कम से कम 1 घंटे के लिए. बाँझ और विभाज्य फ़िल्टर. Tribromoethanol अत्यधिक प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, इसलिए तैयारी और प्रयोग के सभी चरणों में प्रकाश से बचाने के लिए. उपयोग करने से पहले 12-24 घंटे से अधिक नहीं तैयार. Buprenorphine 1 मिलीग्राम / मेथनॉल में मिलीलीटर शेयर समाधान 0.015 मिलीग्राम / मिलीलीटर काम कर समाधान का उपयोग कर बाँझ एच 2 ओ के लिए पतला -20 डिग्री सेल्सियस से कम 1 महीने के लिए स्टोर. Ketoprofen 0.5 मिलीग्राम / DPBS में मिलीलीटर काम कर समाधान DPBS जोड़ें, 37 में रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस 1-2 घंटे के लिए या सभी पाउडर समाधान में चला जाता है जब तक. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस

Discussion

हम vivo वातावरण में एक में hESCs फर्क के भाग्य मानचित्रण के प्रयोजन के लिए एक अत्यधिक कुशल teratoma गठन परख अनुकूल है. विशेष रूप से चयनित hESCs की एक छोटी संख्या undifferentiated जंगली प्रकार hESCs और Phaseolus vulgaris लेक्टिन के लिए एक सेल गोली फार्म के साथ मिलाया जाता है. यह एक immunodeficient माउस में गुर्दे कैप्सूल के नीचे grafted है. मूल चयनित hESCs के भाग्य तो immunohistochemistry (चित्रा 5) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जैसा कि पहले रिपोर्ट (9) . इस विधि सेल आधारित चिकित्सा के लिए ऊतक विशेष अभिकर्मकों की पहचान करने और पैदा करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण उपलब्ध कराता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
2-Methyl-2-butanol		Sigma-Aldrich	240486	Avertin
2,2,2-Tribromoethanol		Sigma-Aldrich	T48402	Avertin
4-0 silk sutures		Ethicon	641G
bFGF		R&D Systems	233FB
Buprenorphine		Sigma-Aldrich	B7536
Clear-Rite 3		Fisher	22-046-341
Collagenase IV		Sigma-Aldrich	C5138
D-MEM		Invitrogen	11965
DPBS		Invitrogen	14190
Dupont #5 forceps		WPI	500233	Kidney capsule
Eosin Y		Fisher	23-245-658
Fetal Bovine Serum (Qualified)		Invitrogen	26140-079
Flex alcohol		Fisher	22-046344
Gill’s Hematoxylin #3		Fisher	22-050-204
Hemostat, straight		WPI	501241	General surgery
Iris forceps		WPI	15914	General surgery
Ketoprofen		Sigma-Aldrich	K2012
KnockOut D-MEM		Invitrogen	10829
KnockOut Serum Replacement		Invitrogen	10828-028
L-glutamine		Invitrogen	25020-081
MILLICELL inserts		Millipore	PICM01250
Nonessential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
Operating scissors		WPI	501754	General surgery
Paraffin (TissuePrep)		Fisher	8002-74-02
Pen/Strep		Invitrogen	15140-122
Permount		Fisher	SP15-100
PHA		Sigma-Aldrich	L1668
Porcine gelatin		Sigma-Aldrich	G6144
ROCK inhibitor		Calbiochem	Y-27632
SCID beige mice		Charles River	250
Scott’s Wash		Fisher	6697-32	Ricca Chemicals
Vannas spring scissors		WPI	14003	Kidney capsule
β-mercaptoethanol		Sigma-Aldrich	M7522