Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام لونين مناعي (رقاقة) لدراسة التغيرات الديناميكية لونين القالب التي تنظم النسخ التي تحدثها إشارة المسار تنبيغ.
Abstract
في استجابة لمجموعة متنوعة من يغاندس خارج الخلية ، وSTAT (محول الإشارات ومنشط من النسخ) ويتم تجنيد عوامل النسخ بسرعة من حالة كامنة في السيتوبلازم لمستقبلات سطح الخلية التي يتم تنشيطها من قبل الفسفرة في بقايا a التيروزين واحدة 1. انهم ثم نقل من مكان لآخر وdimerize إلى النواة لدفع النسخ من الجينات المستهدفة ، والتي تؤثر على النمو ، والتمايز ، والتوازن في الاستجابة المناعية. ليس من المستغرب ، نظرا لمشاركتها على نطاق واسع في عمليات الخلية الطبيعية ، التقلبات وظيفة STAT يسهم في الأمراض التي تصيب البشر ، وخاصة لأمراض السرطان وأمراض المناعة الذاتية 2 3.
ومن الثابت أن النسخ التي تنظم تعديلات على قالب 4،5 لونين. هذه التعديلات تشمل أنشطة ATP التي تعتمد على المجمعات ، فضلا عن تعديلات بسيطة التساهمية والحامض النووي 6. لأن التنشيط STAT التعبير الجيني على حد سواء بسرعة وعابرة ، فإنه يتطلب آليات محددة لونين القالب تحوير الجينات في مواضع STAT - تعتمد. لتحديد هذه الآليات ، ونحن تميز تعديلات بسيطة والأنشطة الأنزيمية التي تولد لهم في مواضع الجينات التي تستجيب لإشارات STAT. يصف هذا البروتوكول مناعي لونين ، وهو الأسلوب الذي هو قيمة لدراسة STAT إشارة إلى لونين في التعبير الجيني تفعيلها.
Protocol
التخطيط
قبل يوم واحد يخطط لتجربة الشذرة ، ينبغي مثقف الخلايا بحيث يتوفر العدد الكافي. نفترض أن كل مقايسة الشذرة سيتطلب ~ 1-1،5 س 10 7 الخلايا. خطة دائما أن تفعل كل من الضوابط السلبية (مفتش) وإيجابية (الضد هيستون عموم) وتجارب مكررة.
تلميح -- للحصول على خلايا 2FTGH ، كل مقايسة الشذرة يتطلب حوالي 15 سم صحن زراعة الأنسجة بنسبة 80 ٪ confluency.
الجزء 1 : الاستعداد لونين وأداء رقاقة
- إزالة وسائل الإعلام والثقافة ، وتحفز الخلايا للمرة المطلوبة مع 20 مل من مصل العجل 10 ٪ الكونية (CCS) / DMEM تحتوي على الإنترفيرون جاما في 5 نانوغرام / مل. استبدال وسائل الاعلام على لوحات uninduced مع 20 مل من 10 ٪ CCS / DMEM كذلك.
- في غطاء الدخان ، إضافة 540 ميكرولتر الفورمالديهايد بنسبة 37 ٪ إلى 20 مل من وسائل الاعلام (تركيز النهائي 1 ٪) في صحن 15 سم.
تلميح -- لوحة الخيمة وإضافة الفورمالدهيد إلى تجمع وسائل الاعلام -- ثم لوحة الصخور لانتشاره بالتساوي. - يشابك تسمح للمضي قدما لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة إلى تركيز جليكاين M 0.125 نهائي لوقف يشابك.
- مخزنة فراغ نضح في وسائل الاعلام وغسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل من الجليد الباردة المالحة الفوسفات (PBS).
- جمع الخلايا مع مكشطة خلية في برنامج تلفزيوني ~ مل (7) والجمع بين الخلايا (من 6 لوحات) التي عولجت مماثل في أنبوب 50 مل المخروطية على الجليد.
- الطرد المركزي (بيكمان Coutler أليجرا 12 - R جهاز طرد مركزي) في 1800 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ونضح في برنامج تلفزيوني.
تلميح -- تجميد أطبق بيليه الخلية إذا كان وقف هنا وتخزينها في -80 درجة مئوية. - Resuspend الكرية خلية في الاحتياطي مل 4 تورم (25 مم HEPES الرقم الهيدروجيني 7.8 ، 1.5 ملي MgCl 2 و 10 ملي بوكل ، 0.1 ٪ NP40 أضف DTT 1 ملم ، ومثبطات الأنزيم البروتيني الكامل على الجليد والبرد قبل الاستعمال) ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي.
تلميح -- وهذا هو حجم التورم العازلة المناسبة لتجميع لوحة 6 (6-9 ~ × 10 7 خلايا). قد العازلة أكثر أو أقل كفاءة douncing تغيير. - احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- نقل إلى تعليق douncer قبل المبردة مل 15 (يتون) وdounce 20 السكتات الدماغية مع ألف مدقة
- dounced نقل مرة أخرى إلى الخلايا المخروطية أنبوب 15 مل على الجليد.
- الطرد المركزي في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف.
- Resuspend الكرية النووي (~ 200 ميكرولتر من 6 لوحات) في 3 مل (15 مجلدا بيليه) من الاحتياطي صوتنة (50 درجة الحموضة HEPES 7.9 ملم ، 140 ملم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 1 ٪ تريتون X - 100 ، deoxycholate الصوديوم 0.1 ٪ ، 0.1 ٪ SDS إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل على الجليد والبرد فقط قبل الاستخدام).
تلميح -- وهذا هو حجم المخزن صوتنة المناسبة لتجميع لوحة 6 (6-9 ~ × 10 7 خلايا). قد العازلة أكثر أو أقل كفاءة صوتنة تغيير. - يصوتن تعليق النوى على الجليد لمدة 10 دورات (20 ثانية on/40 ثانية قبالة / تحديد السعة 8) باستخدام Sonicator Misonix 3000 مجهزة microtip. هذه النتائج عادة في لونين شظايا 200-1000 نقطة أساس في المتوسط في الحجم.
تلميح -- لأن sonicators سوف تختلف ، ويجب تحديد كفاءة صوتنة تجريبيا. للقيام بذلك ، واتخاذ aliquots من 20 ميكرولتر صوتنة قبل وبعد كل دورة صوتنة. حرارة هذه العينات على 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. إضافة DNA العازلة تحميل وتشغيل قياسية 1 ٪ agarose / TBE هلام لتصور شظايا من الحمض النووي). - sonicated نقل المواد إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي SS34 لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في 13000 دورة في الدقيقة في الدوار SS34 (RC6 Sorvall جهاز طرد مركزي بلس) لبيليه ما هو عادة على كمية صغيرة من الحطام الخلية.
- نقل بعناية طاف على أنبوب 15 مل المخروطية على الجليد.
- قبل واضحا من خلال إضافة 360 ميكرولتر الحيوانات المنوية سالمون DNA / البروتين أو agarose G حبات الطين والتأرجح في 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة.
تلميح -- هذه الخطوة تقلل من الضوضاء في الفحص الذي ينشأ من أحداث غير محددة ملزمة. - الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لحبات بيليه في agarose.
- نقل قبل تطهيرها طاف إلى أنبوب آخر مخروطية 15 مل على الجليد.
- وحدات قياس A260 من لونين قبل تطهيرها وضبط حجم الاحتياطي مع صوتنة إلى أربعة (4) وحدات A260 (0.2 ملغ / مل افتراض 1 A260 حدة = 0.050 ملغ / مل)
تلميح -- لقياس وحدات A260 ، تمييع 10 ميكرولتر من قبل مسح لونين في 190 ميكرولتر أحواض دبي الجافة العالمية ؛ معمل فارغة مع 10 العازلة صوتنة ميكرولتر في أحواض دبي الجافة العالمية ميكرولتر 190. - انقاذ 75 ميكرولتر من لونين (A260 في 4 وحدات) كما في نموذج الإدخال وتخزين حتى 20 درجة مئوية حتى على استعداد لعكس crosslinks.
تلميح -- هذه الخطوة الحاسمة لتحليل البيانات. لا تهمل لاتخاذ قسامة الإدخال. - قسامة لونين على استعداد للأنابيب 1.7 مل microfuge على طم كما aliquots مل 1.
تلميح -- إذا توقف هنا ، والمفاجئة تجميد ونين أعد على الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. ملاحظة : يمكن أن تتحلل لونين تخزين وانتاج أقل من النتائج المثلى ، وبالتالي تجنب إذا أمكن ذلك. - إضافة الأضداد الرقائق الصف للعينات التي يسببها وuninduced في مجموعات مكررة. إضافة مفتش (2 ميكروغرام) وعموم الضد H3 هيستون (15 ميكرولتر) والضوابط الإيجابية والسلبية لمجموعات العينات التي يسببها وuninduced.
تلميح -- يجب أن تحدد كمية من الأجسام المضادة لاستخدام تجريبيا أو راجع ورقة المورد المنتج للحصول على المبالغ المقترحة. عادة 1-2 ميكروغرام من الأضداد الرقائق الصف يعمل بشكل جيد. يجب تحديد حجم المناسبة تجريبيا عن الأجسام المضادة التي يتم توفيرها في المصل. - صخرة جميع الأنابيب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
الجزء 2 : COLLECT IMMUNOCOMPLEXES
- إضافة 60 ميكرولتر من الحيوانات المنوية سالمون DNA / البروتين الطين G A أو البروتين الخرز agarose لجميع الأنابيب.
تلميح استخدم البروتين والأجسام المضادة للأرنب النسائل المتعددة ومجموعة البروتين عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس. - صخرة في 4 درجات مئوية على الأقل 60 دقيقة.
- بيليه وimmunocomplexes (الخرز agarose) بواسطة microfuging بلطف على 2000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- نضح لطاف.
- غسل immunocomplexes مع 1 مل من كل من المخازن اغسل التالية لمدة 10 دقيقة مع هزاز في 4 درجات مئوية. Microfuge لمدة 3 دقائق على 2000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية بين كل غسيل ونضح طاف. تبقي العينات المبردة على الثلج. إضافة PMSF فقط قبل استخدامه.
- انخفاض اغسل السلط -- 0.1 ٪ SDS ، 1 ٪ تريتون X - 100 ، 2 EDTA ملم ، 20 ملم تريس - CL ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم PMSF
- ارتفاع اغسل السلط -- 0.1 ٪ SDS ، 1 ٪ تريتون X - 100 ، 2 مم EDTA ، 20 ملي تريس - CL ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 500 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم PMSF
- اغسل LiCl -- 0.25 م LiCl ، 1 ٪ NP - 40 ، 1 ٪ deoxycholate الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 10 ملم تريس - CL ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم PMSF
- TE اغسل -- وهما مع الغسلات -10 ملي TE - CL تريس العازلة ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA ، 1 ملم PMSF
- إزالة مخزن TE النهائي للغسل والخرز ، وإضافة 500 مخزن شطف ميكرولتر (50 ملي تريس - CL ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي EDTA ، SDS 1 ٪).
تلميح -- وينبغي إعداد الاحتياطي شطف حديثا. - الدوامة لخلط حبات agarose في مخزن شطف والحرارة لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
تلميح -- دوامة كل أنبوب على الأقل كل 10 دقائق خلال هذه الدقائق ال 30. - Microfuge لمدة 30 ثانية عند 2000 دورة في الدقيقة ونقل إلى شاطف microfuge أنبوب جديد.
تلميح -- وخلال شطف ، أذاب عينات المدخلات وإضافة 500 مخزن شطف ميكرولتر إلى كل واحد. وتشمل هذه العينات في جميع الخطوات للمضي قدما. - إضافة 5 M كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 200 ملم الى جميع العينات والدوامة.
- في احتضان 65 درجة مئوية خلال الليل (أو على الأقل 4 ساعات).
الجزء 3 : ChIP'd تنقية والدنا INPUT
- Microfuge جميع العينات لمدة 30 ثانية لجمع التكثيف على الأغطية.
- إضافة 1μL من ألف ريبونوكلياز (10 U / ميكرولتر) لكل أنبوب ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- أضف 10 ميكرولتر 0.5 M EDTA ، 40 ميكرولتر 0.5 M - CL تريس الرقم الهيدروجيني 6.5 ، 2 ميكرولتر بروتيناز K (10 ملغ / مل) ، واحتضان عند 45 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. غيض تحضير مزيج الرئيسي من هذه الكواشف وإضافة إلى كل 52 ميكرولتر الأنبوب.
- الفينول / كلوروفورم / isoamyl استخراج الكحول والخمور ثم الكلوروفورم / isoamyl استخراج العينات.
- إضافة 2 ميكرولتر الجليكوجين (25 ميكروغرام / ميكرولتر) و 0.1 درجة الحموضة مجلدات من 3M خلات الصوديوم 5.2 و دوامة.
- إضافة 2.5 أحجام من الإيثانول بنسبة 100 ٪ والدوامة.
- احتضان عند 20 درجة مئوية خلال الليل.
الجزء 4 : ChIP'd تنقية والدنا INPUT تتمة
- عينات Microfuge مدة لا تقل عن 20 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية لترسيب الحمض النووي / الجليكوجين الكريات.
- يغسل مع الحمض النووي / الجليكوجين الكريات مع 1 مل من الايثانول 70 ٪.
- الهواء الجاف أو الكريات تجف بسرعة في سرعة أجهزة الطرد المركزي DNA سافانت فراغ.
تلميح -- لا يجف على الحمض النووي. - Resuspend DNA / الكريات الجليكوجين المخزن في 200 TE ميكرولتر.
- الحمض النووي (1 ميكرولتر) مستعد لالكمي عبر في الوقت الحقيقي PCR. الحمض النووي تخزين المتبقية حتى 20 درجة مئوية.
تلميح -- استخدام أكثر من 1 ميكرولتر من الحمض النووي يمكن أن تمنع في الوقت الحقيقي تفاعلات PCR ، بحيث يصل حجم بحذر.
الجزء 5 : نتائج ممثلة :
وكميا عينات من الحمض النووي مع رقاقة والإدخال في الوقت الحقيقي PCR 7،8 (النظم البيولوجية التطبيقية 7500 السريع في الوقت الحقيقي نظام PCR) باستخدام بادئات محددة على الجين موضع الاهتمام. ويمكن استخدام أجهزة الاشعال أن ذلك الهدف تسلسل الجينوم التخصيب المعروفة أو نقص في تعديلات بسيطة يجري يعاير والضوابط الإيجابية والسلبية كذلك. يتم تقديم البيانات كنسبة مئوية من الدخل. وينبغي أن يكون الإجراء الشذرة كليا صepeated البيولوجية يتطابق مع ثلاثة لضمان التغييرات التي أعلن عنها في تعديلات بسيطة ذات دلالة إحصائية.
هناك العديد من الموضوعات المهمة التي يجب مراعاتها عند استخدام في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الحمض النووي ، بما في ذلك التصميم التمهيدي ، والكفاءة PCR ، والطريقة المناسبة لحساب النسبة المئوية للإجراءات المدخلات والتطبيع. عندما التنميط هيستون الإشغال التعديل عبر الجينات ، ويجب أن تكون متسقة PCR الكفاءة بين جميع أزواج التمهيدي. يمكن للنظام في الوقت الحقيقي PCR الصانع توفير المعلومات اللازمة والتدريب.
الشكل 1 يبين نتائج ممثل لونين immunoprecipitated STAT1 خلال تفعيل هذا الجين IRF1 9 ، نجمت عن الإنترفيرون γ.
الشكل 1. شغل STAT1 ، والجيش الملكي النيبالي الثاني بوليميريز H3K36me3 هي دينامية STAT1 خلال تفعيل هذا الجين IRF1. (A ، B ، C) رقاقة مع α - H3K36me3 ، وSTAT1 α α بول الثاني من لونين التي تم جمعها من الخلايا التي يسببها 2FTGH مع الإنترفيرون γ (30 دقيقة (المربعات الحمراء) ، و 1.5 ساعة (الدوائر الزرقاء) ، و 5 ساعات مثلثات خضراء) أو uninduced (الماس الأسود). مفتش الحكومة هو السيطرة السلبية (رمادي الصلبان) (D) لعموم H3 هو السيطرة الإيجابية ويبين الإشغال هيستون عبر موضع في (الدوائر الزرقاء) والظروف التي يسببها uninduced (الماس الأسود). وحول تراجع -5 غليان ويرجع ذلك إلى استنزاف النيوكليوسومات يتم العثور عليها في مواقع بدء النسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم استخدام بروتوكول الشذرة المذكورة بنجاح في المختبر لفحص أكثر من عشرين تعديلات بسيطة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، لدينا تتميز التغيرات في شغل عوامل النسخ ، هيستون ، بتعديل الانزيمات والبروتينات التي تقر تعديلات بسيطة وآلات النسخ RNA الثاني البلمرة ، في الجينات IFN - γ عدة المستحث. وقد استخدمنا أيضا إجراء تغييرات في لتوصيف تعديلات بسيطة خلال التفريق بين سرطان الخلايا الجذعية 10.
نوعية البيانات الشذرة يعتمد في نهاية المطاف على فعالية الأجسام المضادة المستخدمة ، وهناك تفاوت كبير بين الأضداد. الفشل في رقاقة التعديل ، وبالتالي ، لا يمكن تفسيرها على أنها تعني أنه قال التعديل غير موجود. وعلاوة على ذلك ، قد يتغير في التعديل خاصة لوحظت في تجربة الشذرة تعكس مجرد تغيير في الاعتراف حاتمة من الأضداد الناجمة عن تعديلات إضافية على بقايا هيستون في مكان قريب. لذا ، لا بد من التحقق من صحة النتائج رقاقة مع النهج التي سوف تتصل التغيرات الملحوظة في تعديل هيستون إلى نتيجة البيولوجية. عندما يتم ذلك ، ورقاقة هو وسيلة قوية لدراسة الآليات القائمة على لونين التي تسهم في تنظيم التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل جامعة فيرجينيا ، وجامعة فيرجينيا مركز سرطان وواو وكيت توماس ميلر Jeffress الاستئماني التذكارية. نشكر E. جيمس دارنيل مختبر (جامعة روكفلر) وروبرت روس مختبر (جامعة فوردهام) لخطوط الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
