Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.
Em resposta a uma variedade de ligantes extracelulares, o STAT (transdutor de sinal e ativador de transcrição) fatores de transcrição são rapidamente recrutados a partir de seu estado latente no citoplasma aos receptores da superfície celular, onde elas são ativadas por fosforilação de um resíduo de tirosina único 1. Eles, então, dimerizam e translocar para o núcleo de dirigir a transcrição de genes-alvo, afetando o crescimento, diferenciação homeostase, e da resposta imune. Não é de surpreender, dado o seu envolvimento generalizado nos processos celulares normais, desregulação da função STAT contribui para a doença humana, especialmente para cânceres 2 e doenças auto-imunes 3.
Está bem estabelecido que a transcrição é regulada por alterações ao modelo de cromatina 4,5. Essas alterações incluem as atividades de ATP-dependente complexos, bem como modificações covalentes das histonas e metilação do DNA 6. , Pois a ativação STAT da expressão do gene é rápida e transitória, que requer mecanismos específicos para o modelo modular a cromatina em loci STAT-dependente gene. Para definir esses mecanismos, caracterizamos as modificações das histonas e as atividades enzimáticas que gerá-los em loci de genes que respondem a STAT sinalização. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina, um método que é valioso para o estudo de sinalização para STAT cromatina na expressão dos genes ativados.
O protocolo descrito ChIP tem sido usado com sucesso em laboratório para ensaio de mais de vinte diferentes modificações das histonas. Além disso, têm caracterizado as mudanças na ocupação de fatores de transcrição, histonas modificando-enzimas, proteínas que reconhecem modificações das histonas eo RNA polimerase II maquinaria de transcrição, em vários IFN-γ genes induzidos. Temos também o procedimento utilizado para caracterizar as mudanças em modificações das histonas durante a diferenciação de …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pela Universidade de Virginia, a Universidade de Virginia Cancer Center e The Thomas F. Miller e Kate Jeffress Memorial Trust. Agradecemos ao James E. Darnell Lab (Rockefeller University), a Robert Ross Lab (Fordham University) para linhas de celular.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
DTT | Sigma | D0632 | ||
EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
Glycine | Roche | 100149 | ||
Glycogen | Roche | 901393 | ||
HEPES | Sigma | H3784 | ||
IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
KCl | MP Biologicals | |||
LiCl | Sigma | L4408 | ||
MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
NP40 | US Biological | N3500 | ||
Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
SDS | Fisher | BP166-500 | ||
Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |