Summary
פרוטוקול זה מנצל לנתץ assay כדי לקבוע את רמות של GTPase RhoC פעיל בתוך התאים.
Abstract
RhoC GTPase יש הומולוגיה 91% ל RhoA GTPase. בגלל השכיחות שלה בתאים, ריאגנטים רבים וטכניקות RhoA GTPase פותחו. עם זאת, RhoC GTPase מתבטא תאים סרטניים עם גרורות ברמות נמוכות יחסית. לכן, כמה RhoC ספציפי ריאגנטים פותחו. יש לנו להתאים assay ההפעלה Rho GTPase כדי לזהות RhoC. טכניקה זו משתמשת GST-Rho תחום מחייב היתוך חלבון לשלוף פעיל GTPase RhoC. בנוסף, אנחנו יכולים לקצור חלבון הכולל בתחילת assay כדי לקבוע רמות בסך הכל (GTP והתוצר כבול) GTPase RhoC. זה מאפשר להגדרה של GTPase RhoC פעיל לעומת סך בתא. כמה גירסאות מסחריות של הליך זה פותחו עם זאת, ערכות המסחרי מותאמים RhoA GTPase ובדרך כלל אינם פועלים היטב עבור RhoC GTPase. חלקים של assay שונו, כמו גם פיתוח של נוגדנים RhoC ספציפי.
Protocol
1. הכן GST-Fusion חלבון
- מניות של גליצרול JM109 המכיל חיידקים המוסמכת הראשונה N-מסוף 90 חומצות אמינו של Rho rhotekin מחייב מושלם (RBD) subcloned לתוך pGEX3x BamH1/EcoR1 וקטור נעשים.
על מנת להבטיח יעילות גבוהה השלבים הבאים יש לבצע עבור כל ניסוי. מניסיוננו, המוכן טרי GST-RBD היא המפתח assay חזקים ומדויקים ההפעלה GTPase. - הוסף 50 μL (בקירוב, לא להפשיר) של מניות גליצרול כדי מ"ל של 50 אמפר LB ולגדול 37 ° C במשך הלילה עם רעד.
- מדולל ב 01:10 500 מ"ל LB-amp ולגדול עבור ח 1
- להשרות GST-חלבון הייצור עם mM 0.1 IPTG עבור 2 שעות.
- פזר באופן שווה לתוך בקבוקי צנטריפוגה ו, צנטריפוגה הרוטור Sorval GSA3 ב 5000 סל"ד 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- Resuspend גלולה בבקבוקים צנטריפוגה, 10 מ"ל של חיץ תמוגה *.
* הצפת תמוגה חיידקית: סוכרוז 20%, 10% גליצרול, 50 מ"מ טריס pH 8.0, 0.2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 מ"מ MgCl 2, 2 DTT מ"מ, הוסף PMSF טריים, benzamide, aprotinin ו leupeptin. - Sonicate 2-3 דקות (זה תלוי בסוג של sonicator. אנו משתמשים סוניק פישר Dismembranator דגם 500 נקבע סימן 6, מחזור 50%).
- , צנטריפוגה Sorvall SS34, 20 דקות 10,000 סל"ד ב 4 ° C. בשלב זה aliquot קטנה ניתן להוציא ומנוהל ע"י SDS-PAGE. הג'ל יכול להיות מוכתם coomassie ו להקה צריכה להיות ברורה ב 46 kDa.
- הסר supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 50% glutatione Sepharose slurry-4B.
- דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C עם רוטציה. לשטוף 3 פעמים עם חיץ תמוגה.
- Resuspend חרוזים GST-RBD/glutatione-Sepharose כדי slurry של 50% (כ 1 מ"ל) עם חיץ GST דגים **. ** GST-Fish הצפת: גליצרול 10%, 50 מ"מ טריס pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 מ"מ MgCl 2, הוסף PMSF טריים, benzamide, aprotinin ו leupeptin
2. GST-Fusion לנתץ assay
- השתמש 5-10 x 10 6 תאים / assay
- שטפו תאים פעם קרים PBS, לשמור על צלחות על הקרח (אנו משתמשים צלחת זכוכית שטוחה מלא קרח) ו lyse עם חיץ 0.5 GST דגים מ"ל.
- דגירה 5 דקות על הקרח, תאים הקציר בעזרת שוטר גומי או scrapper שטוח, להעביר microfuge צינור צנטריפוגות 20,000 סל"ד 5 דקות ב 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור microfuge טריים. קח 50 μL לקבוע Rho הכולל (כלומר, התמ"ג + GTP קשור).
- הוסף 0.5 מ"ל ו GST-RBD/glutatione-Sepharose חרוזים דגירה על 4 ° C, לילה עם רוטציה.
- לשטוף 6x עם חיץ GST דגים.
- חרוזים Resuspend במאגר 40 2x-Laemelli μL מדגם
בנקודה זו ריכוז aliquot Rho הכולל חלבון נלקח 2.4 צריך להיקבע ו -30 מיקרוגרם מוכן להפעיל על הג'ל עם מדגם ההפעלה המתאימה. - דגימות מרתיחים על 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, צנטריפוגה בקצרה לקחת עומס supernatant (כלומר, למנוע את החרוזים) ו לרוץ על שיפוע של 12 באר 4-20% SDS-PAGE ג'ל.
- הפעל ג'ל ב 150 וולט גבוה יותר מאשר לא, להעביר באמצעות קרום חיץ Towbin וקבוע הנוכחי של 100 W.
- בלוק קרום עם פתרון חלב / TBST 5% ו בדיקה עם נוגדן RhoC-specfic.
3. נציג תוצאות
תוצאות טובות צריך לייצר להקה אחת על כ 22 kDa. תוצאות Bad לייצר להקות מרובות או רקע גבוה. זה מעיד על פירוק חלבונים, כביסה שלם של דגימות או שימוש הישנה GST-RBD.
באיור 1. שלוש שורות תאים נפרדים להביע רמות שונות של RhoC GTPase מוצגים להפגין רמות נמוכות של RhoC פעיל בסך הכל, רמות גבוהות של RhoC פעיל מוחלט או לא RhoC. כתם הופשט אז reprobed עם נוגדן ל אקטין שמירה על הבית הגן לשמש שליטה טעינת לחלבון RhoC מוחלט.
איור 2. להקות מרובות או רקע תוצאות גבוהות מן פירוק חלבונים, כביסה שלם של דגימות או השימוש הישן GST-RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלב הקריטי ביותר של ההליך הוא דור של טרי GST-RBD. אי לשים לב בשלב זה היא הסיבה העיקרית לכישלון. כל המדרגות, מדור של GST-RBD (1.2) כדי הדגירה לילה עם lysate התא (2.5), צריך להיעשות ביום אחד. צעד נוסף הוא חיוני כדי לוודא שיש מספיק תאים כדי להפיק את lysates התא. זו היא בעלת חשיבות מיוחדת כאשר מסתכלים RhoC GTPase, שנוטה להיות נוכח רמות נמוכות בתא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחלקת הביטחון W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ו W81XWH-08-1-0356
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | Bio-Rad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. van Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. van Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
