इस प्रोटोकॉल परख नीचे एक पुल का इस्तेमाल करने के लिए कोशिकाओं के भीतर सक्रिय RhoC GTPase के स्तर का निर्धारण.
Abstract
RhoC GTPase RhoA GTPase 91% अनुरूपता है. कोशिकाओं में इसकी व्यापकता के कारण, कई RhoA GTPase के लिए अभिकर्मकों और तकनीक को विकसित किया गया है. हालांकि, RhoC GTPase अपेक्षाकृत कम स्तर पर metastatic कैंसर की कोशिकाओं में व्यक्त किया है. इसलिए, कुछ RhoC विशेष अभिकर्मकों विकसित किया गया है. हम एक रो सक्रियण परख RhoC GTPase का पता लगाने के अनुकूल है. इस तकनीक को जीएसटी – रो बाध्यकारी डोमेन संलयन सक्रिय RhoC GTPase खींच प्रोटीन का इस्तेमाल करता. इसके अलावा, हम परख की शुरुआत में कुल प्रोटीन फसल के कुल का स्तर (जीटीपी और सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) बाउंड) RhoC GTPase निर्धारित कर सकते हैं. यह सेल में सक्रिय बनाम कुल RhoC GTPase के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. लेकिन इस प्रक्रिया के कई व्यावसायिक संस्करण विकसित किया गया है, वाणिज्यिक किट RhoA GTPase के लिए अनुकूलित कर रहे हैं और आमतौर पर अच्छी तरह से RhoC GTPase के लिए काम नहीं करते. परख की भाग RhoC विशिष्ट एंटीबॉडी के विकास के रूप में किया गया है के रूप में अच्छी तरह से संशोधित.
Protocol
1. तैयार करें प्रोटीन जीएसटी-संलयन JM109 सक्षम पहली एन टर्मिनल rhotekin रो बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी) के 90 अमीनो एसिड BamH1/EcoR1 pGEX3x वेक्टर में subcloned वाले जीवाणुओं की ग्लिसरॉल शेयरों बना रहे हैं. उच्च दक्षता सुनिश्…
Discussion
प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम ताजा जीएसटी – आरबीडी की पीढ़ी है. इस कदम के करीब ध्यान देना करने में विफलता विफलता के लिए मुख्य कारण है. जीएसटी आरबीडी (1.2) की पीढ़ी से सेल lysate (2.5) के साथ रात भर ऊष्मायन सभी चर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
रक्षा विभाग W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 और W81XWH-08-1-0356