Detta protokoll använder sig av en pull down analys för att bestämma nivåerna av aktiva RhoC GTPase i celler.
Abstract
RhoC GTPase har 91% homologi till RhoA GTPase. På grund av dess förekomst i celler, har många reagenser och tekniker för RhoA GTPase utvecklats. Det är dock RhoC GTPase uttrycks i metastaserande cancer celler på relativt låga nivåer. Därför har få RhoC-specifika reagenser utvecklats. Vi har anpassat en Rho aktivering test för att upptäcka RhoC GTPase. Denna teknik utnyttjar en GST-Rho bindande protein domän fusion att dra ut aktiva RhoC GTPase. Dessutom kan vi skörda totalprotein i början av analysen för att bestämma nivåerna av total (GTP och BNP bundna) RhoC GTPase. Detta möjliggör för bestämning av aktivt kontra totala RhoC GTPase i cellen. Flera kommersiella versioner av detta förfarande har utvecklats är dock den kommersiella kit optimerad för RhoA GTPase och normalt inte fungerar bra för RhoC GTPase. Delar av analysen har modifierats, liksom utveckling av en RhoC-specifik antikropp.
Protocol
1. Förbered GST-fusionsprotein Glycerol lager av JM109 behöriga bakterier som innehåller den första N-terminal 90 aminosyror med rhotekin Rho bindande domän (RBD) subcloned i BamH1/EcoR1 pGEX3x vektor görs. Att säkerställa hög effektivitet följande steg måste genomföras för varje experiment. Vår erfarenhet är nygjord GST-RBD är nyckeln till ett robust och exakt GTPase aktivering analys. Tillsätt 50 mikroliter (ungefärliga, inte tina) av glycerol lager till 50 ml LB amp…
Discussion
Det mest kritiska steget i förfarandet är den generation av färska GST-RBD. Underlåtenhet att ägna stor uppmärksamhet åt detta steg är främsta orsaken till misslyckande. Alla steg, från generation av GST-RBD (1,2) till natten inkubation med cellen lysat (2,5), bör göras i en enda dag. En annan avgörande steg är att se till att det finns tillräckligt med celler att producera cellen lysates. Detta är särskilt viktigt när man tittar på RhoC GTPase, som tenderar att vara närvarande i låga halter i celle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Institutionen för Defense W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 och W81XWH-08-1-0356