הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Summary

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

Abstract

החוויה החזותית שלנו היא יזמה כאשר הפיגמנט חזותית קולטני האור ברשתית שלנו סופג אנרגיה של פוטונים אור יוזם מפל של אירועים תאיים שמובילים סגירת מחזורית-נוקלאוטיד-מגודרת תעלות בקרום התא. השינוי וכתוצאה מכך פוטנציאל קרום מוביל בתורו להפחתה בסכום של שחרור הנוירוטרנסמיטר מן המוט וגם מסופי חרוט הסינפטי. כדי למדוד כיצד לשנות אור עורר בפוטנציאל הממברנה photoreceptor מוביל פעילות הזרם ברשתית, הצליחו המדענים הקלטות אלקטרו מן ההכנות פרוסה רשתית עבור ^1,2 עשורים. בעבר פרוסות אלה קוצצו באופן ידני בסכין גילוח על רקמת הרשתית המצורפת נייר מסנן: בשנים האחרונות שיטה אחרת של חיתוך פותחה לפיה רקמת הרשתית מוטבע אגר gelling נמוך הטמפרטורה פרוס פתרון מגניב עם רוטט microtome ^3,4. הכנה זו מייצרת פרוסות רשתית עם נזק משטח פחות ותגובות אור עורר מאוד חזקים. כאן אנו מסמך כיצד הליך זה יכול להתבצע תחת אור אינפרא אדום, כדי למנוע הלבנת הפיגמנט חזותית.

Protocol

1. הכנת אלקטרודות

1. הכן את האלקטרודות הקלטה הפניה על ידי טבילה שניהם NaCl 1M ונהיגה 15V ביניהם באמצעות גל סינוס 1 הרץ עבור ~ 20 שניות
2. הפוך את האלקטרודות הקלטה באמצעות חולץ micropipette (סאטר מכשירי P-97). עבור תיקון-pipettes להשתמש בורוסיליקט זכוכית בקוטר חיצוני של 1.2 מ"מ ו בקוטר הפנימי של 0.69 מ"מ (סאטר מכשירים, חתול # B120-69-10). מדוד את התנגדות סדרה דרך קצה האלקטרודה. בהתבסס על גודל התאים היעד לבחור קוטר קצה פיפטה, עבור גופי התא ~ 20 מיקרומטר להשתמש בקוטר 5 ~ MΩ עבור גופי התא ~ 5 מיקרומטר להשתמש בקוטר ~ 12 MΩ.
3. הכנת הקרקע / אלקטרודות התייחסות. באמצעות מזרק למלא קטע קטן צינורות פוליאתילן (Intramedic, PE205) עם 1 mM NaCl הכוללת אגר 3.5% (Sigma, חתול # A7002) ב NaCl 1M. המקום הזה אגר גשר מעל אלקטרודת Ag / AgCl ההתייחסות.

2. הכנת פתרונות

1. אמבטיה פתרון חיצוני, "מדיה המכילה ביקרבונט (1 ליטר): 1 בקבוק איימס איימס בינוני (Sigma, חתול # A1420), 1.9 גרם של NaHCO _3, 7 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין (Sigma, חתול # P0781) כדי למנוע חיידקים צמיחה. התאם osmolarity כדי mOsm 280 ~.
2. חיתוך פתרון, "מדיה המכילה את מאגר ה-pH HEPES (1 ליטר): 1 בקבוק איימס איימס בינוני, 0.887 גרם של NaCl, 2.38 גרם של HEPES, 7 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין. התאם את ה-pH ל ~ 7.4 באמצעות 1M NaOH ו / או 1M HCl. התאם osmolarity כדי mOsm 280 ~.
3. אשלגן-Aspartate (K-ASP) פתרון פיפטה פנימי (מ"מ): 125-K-Aspartate, KCl 10, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0.5 CaCl _2, 1-ATP מ"ג, 0.2 מ"ג GTP; pH מותאם ~ 7.3 עם NMG-OH, ו osmolarity מותאם mOsm 280 ~.
4. לבלימת הכדור אגר לייצוב טמפרטורה נמוכה gelling agarose המכיל את הרשתית (5% לפי משקל), 7.5 גרם של אגר (Sigma, חתול # A7002) נמס 150 מ"ל של DH ₂ O.

3. יום של הניסוי

1. הפשירי ~ 1.5 מ"ל של פתרון פנימי K-ASP ו fluorophore על פי בחירתך מהמקפיא. לדלל את fluorophore לריכוז המתאים, אשר יש לקבוע באופן אמפירי.
2. יוצקים התקשורת "איימס המכיל NaHCO ₃ (~ 200 מ"ל) לתוך מיכל אור חזק האחסון ולאחר מכן למקם לאמבטיה מים (30-32 ° C) לאזן עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ גז
3. מלאו בקבוק עם 110 מ"ל ~ של התקשורת "איימס המכיל HEPES, במקום על קרח לאזן עם 100% O _2.
4. מניחים את שאר כלי התקשורת "איימס המכיל NaHCO ₃ במאגר מחומם על גבי כלוב פאראדיי, והוא לאזן עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ גז. Parafilm ניתן להשתמש כדי ללכוד את הגז בחלל מעל הפתרון.
5. הכן את הטמפרטורה הנמוכה gelling agarose (3%) על ידי הוספת 0.75 גרם (Sigma, חתול # A0701) ל 25 מ"ל של התקשורת "איימס עם HEPES והפתרון חום ~ 115 ° C כדי להמיס את agarose. מערבבים עד הפתרון ברור ללא בועות, ולאחסן באמבט מים (~ 42 ° C).
6. מלאו פיפטה הקלטה עם פתרון K-Asp הפנימי לבדוק את קצה ההתנגדות.

4. בגין הניסוי

1. להרדים את העכבר במהירות להסיר את העיניים בעזרת מספריים מעוקל. משקפי אינפרא אדום אמור לשמש עבור כל ההליכים כדי למנוע הלבנת של פיגמנט הראייה.
2. מניחים את עיניו על פיסת נייר סינון כדי למנוע מהם להתגלגל, באמצעות להב דק דו צדדי, לבצע חתך בקרנית בעוד מחזיק את העין עם מלקחיים.
3. ברגע את גלגל העין הוא ניקב, העברת הם העין לתוך צלחת מלא עם התקשורת "איימס.
4. באמצעות חתך בקרנית כנקודת כניסה, מספריים קטנים המשמשים לחתוך את החלקים הנותרים של הקרנית, לאחר מכן את העדשה זגוגי ניתן להסירו. היזהר כי הרשתית נשאר מחובר עיינית, ולאחסן את עיינית בחושך ב 32 ° C בתקשורת equilibrated עם 5% CO ₂ / 95% O ₂ "איימס.

5. פלוח

1. Hemisect אחד eyecups ו לנתק את הרשתית של אפיתל הפיגמנט ברשתית. הסר את הקצוות של הרשתית, כדי לאפשר לרקמות לשכב.
2. השתמש בכוס קטנה פיפטה פסטר עם נורת לטקס למלא צלחת פטרי 35 מ"מ עם אגר מומס, וגרור את פני באמצעות מלקחיים אגר כדי לבדוק עקביות שלה.
3. כאשר אתה יכול להתחיל לראות אגר לחזק:
   1. מעבירים את הרשתית לחלק העליון של אגר.
   2. השתמש חתיכת מעוות של Kimwipe לספוג את הפתרון עודף סביב הרשתית.
   3. מקום 2-3 טיפות של אגר ישירות על גבי הרשתית במהירות למקום גליל פלסטיק על הרשתית להקים גדר מסביב. ואז לטפטף אגר נמס נוסף לצדי גליל הפלסטיק תוך מרכוז הרשתית בתוך אגר.
   4. מעבירים את צלחת פטרי to מי קרח אמבטיה להתקרר.
4. לאחר ~ 45 שניות להסיר את הרקמה מן הרחצה במי קרח ולהשתמש הבוכנה כדי extrude אגר לחסום מתוך גליל הפלסטיק, דוחפים מהצד הרחוק ביותר מן הרשתית.
5. השתמש בלהב חד צדדי גילוח לחתוך את גוש קטן של אגר המכיל את הרשתית ואת הדבק את הבלוק למקום נגד גדר המגרש אגר בדיסק הדגימה.
6. העברת את הדיסק הדגימה למגש microtome רוטט ויוצקים קרים HEPES איימס למגש המאפשר לחסום עם הרשתית להיות טבלו מלא.
7. רשתית פרוסות בעובי של ~ 200 מיקרומטר ניתן לחתוך בשיעור המרבי להב רוטט ומהירות להב קדימה סט כזה, כי זה לוקח 4-5 שניות כדי לחתוך דרך הרשתית על כל פרוסה.
8. השתמש להב 11 מס 'אזמל כדי להסיר כל פרוסה אחת שמיש בכל פעם
9. פרוסות טוב המכיל ברשתית ממוקמים לתאי הקלטה משוקללים למטה עם עוגנים פרוסה עם חוטי ניילון מעבר להם. חוטי ניילון החזק את אגר המקיפים את הרשתית, משאירים את הרשתית בלא הפרעה עבור הקלטות.
10. העברה לתא הקלטה לשלב של המיקרוסקופ זקוף, לסגור את הווילון להפעיל את מקור האור האינפרא אדום כדי להציג את הפרוסה על מצלמת אינפרא אדום רגיש.

6. הקלטה

1. לאחר פרוסת רשתית טוב (עם photoreceptors שלם זווית חיתוך מתאים) מזוהה להתחיל המרוססת הרשתית בשיעור של יותר מ -5 mL / min עם התקשורת איימס "כי מחומם מחוממת 35 37 ° C ו equilibrated עם 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. כמה נזק משטח עשוי להיות ניכר, בשל תהליך חיתוך. שכבה זו של תאים דקה בדרך כלל ניתן להסיר בעזרת פיפטה עם קצה שבור, בעדינות למצוץ ממנו את גופי התא מת. זה יהיה בדרך כלל חושפים תאים חיים מתחת. זהה את גוף התא בריא שמעמדם נמצא בשכבות של עניין.
3. מילוי micropipette עם פתרון הפנימי KAsp ולהפעיל לחץ חיובי (החוצה) דרך קצה פיפטה, ולהפחית את קצה פיפטה החדרה הקלטה עד לרמת התא באמצעות micromanipulator.
4. העבר את קצה פיפטה כזאת שזה הגומות של קרום התא, ולהחיל עדין לחץ שלילי (פנימה) כדי להפוך את חותם עמידות גבוהה. שלמות התא במצב יכולה להיות מושגת על ידי הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה לפרוץ לתוך התא.
5. מגרה את רקמת הרשתית באמצעות נוריות אז יכול לעורר תגובות לאור.
6. צילום התא שממנו ההקלטה נעשתה על ידי לעורר הקרינה מן fluorophore בפתרון טפטפת פנימית.

7. נציג תוצאות

באיור 1. כאן, אור עורר הפוטנציאלים של אפל המותאמות נוירון הרשתית אל הבזקי אור של כוח הגדלת מוצגים.

איור 2. תמונה הקרינה מן פרוסת ברשתית שבו התאים היו מלאים fluorophore, לוציפר צהוב. הקרינה עורר מראה את המורפולוגיה של תאים שמהם הקלטות תיקון נעשו.

Discussion

הקלטה פורסים מן הרשתית חוליות נעשו במשך עשרות שנים ^1,2, ואת כבר די מוצלח במתן הבנה עמוקה יותר של האופן שבו המעגלים רשתית מקודד אור התקרית. היתרונות של חיתוך עם microtome רוטט ולא ישירות עם סכין גילוח היא פרוסות רשתית להיגרם נזק פחות על פני השטח. עם טפטפת יניקה קל להסיר נזק לתאים בריאים היעד מתחת לפני השטח, כי לשמור על קישוריות שלהם במעגל הרשתית, שם רוב סוגי תאים זוהו ^5,6, וכי התגובות חזקים להציג לאור. כך מהדק תיקון הקלטות כהה מותאם פרוסות רשתית יכולה להרשות חוקר על מנת לקבוע את התפקיד שמילאו כיתות תא מזוהה חישובים עצביים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781