Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Summary

Qui si descrive una procedura per la generazione di dark-adattato fette della retina del mouse per le registrazioni elettrofisiologiche.

Abstract

La nostra esperienza visiva è iniziata quando il pigmento visivo nel nostro fotorecettori della retina assorbe i fotoni di energia luminosa e avvia una cascata di eventi intracellulari che portano alla chiusura del ciclico-nucleotide-gated canali nella membrana cellulare. Conseguente cambiamento di potenziale di membrana porta a sua volta alla riduzione della quantità del rilascio di neurotrasmettitore da entrambi i terminali asta e cono sinaptica. Per misurare come il cambiamento di luce evocati del potenziale di membrana dei fotorecettori porta ad attività a valle nella retina, gli scienziati hanno effettuato registrazioni elettrofisiologiche da preparazioni fetta della retina per ^1,2 decenni. In passato queste fette sono state tagliate manualmente con una lama di rasoio sul tessuto retinico che è collegato a carta da filtro, in questi ultimi anni un altro metodo di taglio è stato sviluppato per cui tessuto retinico è incorporato in agar a bassa temperatura di gelificazione e affettati in soluzione fredda con un vibrante microtomo ^3,4. Questa preparazione produce fette della retina con danni superficiali e meno risposte luce evocata molto robusto. Qui documentare come questa procedura può essere fatta sotto la luce a infrarossi per evitare lo sbiancamento del pigmento visivo.

Protocol

1. Elettrodi preparazione

1. Preparare gli elettrodi di registrazione e di riferimento per immersione entrambi in 1M NaCl e guida 15V tra di loro utilizzando un 1 sinusoide Hz per ~ 20 s.
2. Rendere gli elettrodi di registrazione con un estrattore micropipetta (Sutter Instruments P-97). Per le patch-pipette utilizzare un vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,2 mm e un diametro interno di 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Misurare la resistenza serie attraverso la punta dell'elettrodo. In base alle dimensioni delle cellule bersaglio scegliere un diametro puntale; per corpi cellulari ~ 20 micron di diametro utilizzare ~ 5 MΩ per corpi cellulari ~ 5 micron di diametro utilizzare ~ 12 MW.
3. Preparare terra / elettrodi di riferimento. Utilizzando una siringa riempire un piccolo tubo di polietilene sezione (Intramedic, PE205) con 1 mM di NaCl, che include 3,5% agar (Sigma; Cat # A7002) in NaCl 1M. Posto questo ponte agar negli Ag / AgCl elettrodo di riferimento.

2. Soluzioni per la preparazione

1. Bagno di soluzione esterna, Ames 'supporti contenenti bicarbonato (1 L): 1 bottiglia di Ames' Media (Sigma; Cat # A1420), 1,9 g di NaHCO _3, 7 ml di penicillina-streptomicina (Sigma; Cat # P0781) per evitare che batteri crescita. Regolare osmolarità a ~ 280 mOsm.
2. Affettare soluzione, Ames 'supporti contenenti il ​​HEPES pH (1 L): 1 bottiglia di Ames' media, 0,887 g di NaCl, 2,38 g di HEPES, 7 ml di penicillina-streptomicina. Portare il pH a ~ 7,4 con NaOH 1M e / o HCl 1M. Regolare osmolarità a ~ 280 mOsm.
3. Potassio-aspartato (K-Asp) soluzione di pipetta interne (in mm): 125 K-aspartato, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH viene regolato ~ 7.3 con NMG-OH, e osmolarità è regolato ~ 280 mOsm.
4. Backstop agar per la stabilizzazione a bassa temperatura di gelificazione agarosio contenente la retina (5% in peso), 7,5 g di agar (Sigma; Cat # A7002) sciolto in 150 ml di dH ₂ O.

3. Giorno di Esperimento

1. Scongelare ~ 1,5 mL di K-Asp soluzione interna e il fluoroforo di vostra scelta dal congelatore. Diluire il fluoroforo alla concentrazione adeguata, che dovrebbe essere empiricamente determinato.
2. Versare Ames 'supporti contenenti NaHCO ₃ (~ 200 mL) nella luce contenitore a tenuta stagna di stoccaggio e poi posto nella vasca d'acqua (30-32 ° C) ed equilibrare con il 5% di CO ₂ / 95% O ₂ gas
3. Riempire bottiglie con ~ 110 mL di media Ames 'contenente HEPES, posto su ghiaccio ed equilibrare con il 100% O _2.
4. Mettere il restante Ames 'supporti contenenti NaHCO ₃ in un serbatoio riscaldato in cima alla gabbia di Faraday, ed equilibrare con il 5% di CO ₂ / 95% O ₂ gas. Parafilm può essere utilizzato per intrappolare il gas nello spazio sovrastante la soluzione.
5. Preparare la bassa temperatura di gelificazione agarosio (3%) con l'aggiunta di 0,75 g (Sigma; Cat # A0701) a 25 mL di media Ames 'con HEPES e riscaldare la soluzione a ~ 115 ° C per sciogliere l'agarosio. Mescolare fino a quando la soluzione limpida senza bolle, e conservare in un bagno d'acqua (~ 42 ° C).
6. Riempire una pipetta di registrazione con il K-Asp soluzione interna e controllare la resistenza punta.

4. Iniziare Esperimento

1. Euthanize il mouse e rimuovere rapidamente gli occhi con le forbici curve. Occhiali a raggi infrarossi deve essere utilizzato per tutte le procedure per prevenire lo sbiancamento del pigmento visivo.
2. Mettere gli occhi su un pezzo di carta da filtro per impedire loro di rotolamento, e utilizzando una sottile lama a doppio lato, praticare un'incisione nella cornea mentre si tiene l'occhio con le pinze.
3. Non appena il bulbo oculare è forato, trasferimento che gli occhi in un piatto pieno di mezzi di Ames '.
4. Utilizzando la fessura nella cornea come punto di ingresso, forbicine sono usati per tagliare via le parti rimanenti della cornea, dopo di che l'obiettivo e il corpo vitreo può essere rimossa. Fare attenzione che la retina rimane attaccato al oculare, e conservare l'oculare nel buio a 32 ° C in media equilibrata con 5% di CO ₂ / 95% O ₂ Ames '.

5. Affettare

1. Hemisect uno degli oculari e dissociare la retina da dell'epitelio pigmentato retinico. Rimuovere i bordi della retina per permettere al tessuto di mentire piatto.
2. Utilizzare un piccolo bicchiere pipetta Pasteur con un bulbo in lattice per riempire un piatto 35 millimetri Petri con agar fuso, e trascinare il forcipe che attraversi l'agar per testare la sua consistenza.
3. Quando si può cominciare a vedere l'agar solidificare:
   1. Trasferire la retina alla parte superiore della agar.
   2. Usare un pezzo ritorto di Kimwipe per assorbire l'eccesso di soluzione attorno alla retina.
   3. Luogo 2-3 gocce di Agar direttamente sulla retina e rapidamente posto un cilindro di plastica sopra la retina per formare un muro intorno. Poi a goccia ulteriori agar fuso ai lati del cilindro di plastica mentre centrare la retina all'interno del agar.
   4. Trasferire la piastra di Petri to un bagno di acqua ghiacciata per raffreddare.
4. Dopo ~ 45 secondi rimuovere il tessuto dal bagno acqua ghiacciata e utilizzare un pistone per estrudere l'agar blocco fuori dal cilindro di plastica, spingendo dal lato più lontano dalla retina.
5. Utilizzare il unilaterale lama di rasoio per tagliare un piccolo blocco di agar contenente la retina e supercolla il blocco in posizione contro l'arresto agar sul disco campione.
6. Trasferire il disco di preparato al vassoio microtomo vibrante e versare il ghiaccio freddo HEPES Ames nel cassetto che permette il blocco con la retina di essere completamente sommerso.
7. Fette della retina con uno spessore di circa 200 micron può essere tagliato al tasso massimo lama vibrante e una velocità di lama in avanti impostato in modo che ci vogliono 4-5 secondi per tagliare la retina su ogni fetta.
8. Utilizzare una lama di bisturi n ° 11 per rimuovere ognuna utilizzabile fetta alla volta
9. Fette di buon contenenti retina sono inseriti in alloggiamenti di registrazione e sono ponderati con le ancore fetta con fili di nylon che li attraversano. I fili di nylon tenere premuto l'agar circostanti della retina, lasciando la retina senza ostacoli per le registrazioni.
10. Trasferire la camera di registrazione alla fase del microscopio in posizione verticale, chiudere le tende e accendere la sorgente di luce a infrarossi per visualizzare la fetta su una telecamera a raggi infrarossi sensibile.

6. Registrazione

1. Una volta che una buona fetta della retina (fotorecettori con intatta e l'angolo di taglio del caso) viene identificato iniziare perfusione la retina ad un tasso superiore a 5 ml / min con i media riscaldata Ames 'che viene riscaldato a 35 37 ° C ed equilibrata con 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. Alcuni danni superficie può essere evidente a causa del processo di taglio. Questo strato di solito sottile di cellule possono essere rimosse con una pipetta con una punta rotta, e delicatamente succhiare via i corpi delle cellule morte. Questo genere rivelare cellule vive sotto. Identificare un corpo sano cellula la cui posizione si trova negli strati di interesse.
3. Riempire una micropipetta con la soluzione KAsp interno e applicare positivo (verso l'esterno) della pressione attraverso la punta della pipetta, e abbassare la punta della pipetta nella camera di registrazione e fino al livello della cellula con un micromanipolatore.
4. Spostare la punta della pipetta tale da fossette la membrana cellulare, e applicare dolce negativa (verso l'interno), la pressione per fare un sigillo ad alta resistenza. A cellula intera modalità può essere ottenuto mediante l'applicazione di pressione negativa per l'elettrodo di entrare in cella.
5. Stimolare il tessuto retinico tramite LED possono evocare reazioni alla luce.
6. Fotografare la cella da cui è stata effettuata la registrazione evocando fluorescenza dal fluoroforo pipetta nella soluzione interna.

7. Rappresentante Risultati

Figura 1. Qui, la luce potenziali evocati di un adattato all'oscurità dei neuroni della retina di lampi di luce di forza maggiore sono mostrati.

Figura 2. Un'immagine fluorescenza da una fetta della retina in cui le cellule sono stati riempiti con il fluoroforo, Lucifero Giallo. Fluorescenza evocato mostra la morfologia delle cellule da cui sono state fatte le registrazioni di patch.

Discussion

Registrazione fetta di retina dei vertebrati sono state fatte per decenni ^1,2, e sono stati molto efficaci nel fornire una comprensione più profonda di come i circuiti della retina codifica luce incidente. I vantaggi del taglio con un microtomo vibrante, piuttosto che direttamente con una lama di rasoio è che le fette della retina incorrere meno danni in superficie. Con una pipetta di aspirazione è facile da rimuovere questi danni e le cellule bersaglio sane appena sotto la superficie che conservano la loro connettività nel circuito della retina, dove la maggior parte dei tipi cellulari sono stati identificati ^5,6, e che le risposte visualizzare robusto alla luce. Così le registrazioni di patch clamp da adattato all'oscurità fette retina può consentire ad un investigatore di determinare il ruolo svolto dalle classi cella identificata nei calcoli neurale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781