تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Summary

نحن هنا وصف الإجراء لتوليد داكنة تكييفها شرائح من شبكية العين الماوس للتسجيلات الكهربية.

Abstract

يبدأ خبرتنا البصرية عندما الصباغ البصرية في الشبكية لدينا مبصرات تمتص فوتونات الضوء والطاقة تبدأ سلسلة من الأحداث داخل الخلية والتي تؤدي إلى إغلاق دوري - النوكليوتيدات بوابات قنوات في غشاء الخلية. التغيير المحتملة الناتجة في الغشاء يؤدي بدوره إلى انخفاض في كمية الافراج العصبي من كل قضيب ومحطات مخروط متشابك. لقياس مدى التغير في ضوء أثار احتمال غشاء مبصرة يؤدي إلى نشاط المصب في شبكية العين ، جعلت العلماء التسجيلات الكهربية من الاستعدادات لشريحة الشبكية ^1،2 عقود. في الماضي قطعت هذه الشرائح يدويا بشفرة حلاقة على أنسجة الشبكية التي تعلق على ورقة فلتر ، وفي السنوات الأخيرة تم تطوير طريقة أخرى للتشريح يتم بموجبها جزءا لا يتجزأ من نسيج الشبكية في التبلور انخفاض درجة الحرارة وآغار شرائح في محلول بارد مع تهتز مشراح ^3،4. هذا التحضير تنتج شرائح الشبكية مع أقل الأضرار السطحية وقوية جدا للضوء ردود أثار. نحن هنا الوثيقة كيف يمكن القيام بهذا الإجراء تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتفادي تبييض صبغة بصرية.

Protocol

1. يستعد أقطاب

1. إعداد الأقطاب تسجيل وغمس إشارة لهم على حد سواء في كلوريد الصوديوم 1M والقيادة 15V بينهما باستخدام شرط 1 هرتز لموجة ثانية 20 ~
2. جعل أقطاب تسجيل باستخدام مجتذب micropipette (سوتر الآلات P - 97). للتصحيح ، ماصات استخدام الزجاج البورسليكات مع القطر الخارجي من 1.2 ملم وقطرها الداخلي 0.69 مم (سوتر الآلات ، القط # B120 - 69 - 10). قياس المقاومة من خلال سلسلة غيض من القطب. استنادا إلى حجم الخلايا المستهدفة اختيار القطر تلميح ماصة ؛ للهيئات الخلية ~ 20 ميكرون في القطر استخدام ~ 5 MΩ للهيئات الخلية ~ 5 ميكرون في القطر استخدام MΩ ~ 12.
3. إعداد الأرض / أقطاب المرجعية. استخدام حقنة ملء البولي ايثيلين أنابيب قسم صغير (Intramedic ، PE205) مع كلوريد الصوديوم 1 مم يتضمن آجار 3.5 ٪ (سيغما ؛ القط # A7002) في كلوريد الصوديوم 1M. هذا الجسر المقام فوق القطب آغار المرجعية حج / AgCl.

2. إعداد حلول

1. حل حمام خارجي ، 'وسائل الإعلام التي تحتوي على كربونات (1 L) : 1 زجاجة من أميس' أميس متوسطة (سيغما ؛ القط # A1420) ، 1.9 غرام من NaHCO _{3 و} 7 مل من البنسلين ، الستربتوميسين (سيغما ؛ القط # P0781) لمنع البكتيريا النمو. ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~.
2. تشريح الحل "، الذي يحتوي على وسائل الاعلام HEPES العازلة الرقم الهيدروجيني (1 L) : 1 زجاجة من أميس' أميس متوسطة ، 0.887 غرام من كلوريد الصوديوم ، 2،38 غرام من HEPES ، 7 مل من البنسلين ، الستربتوميسين. ضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.4 1M باستخدام هيدروكسيد الصوديوم و / أو حمض الهيدروكلوريك 1M. ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~.
3. البوتاسيوم الأسبارتات حل ماصة (K - ASP) الداخلي (مم) : 125 K - الأسبارتات ، 10 بوكل ، 10 HEPES ، 5 - NMG HEDTA ، 0.5 CaCl ₂ ، 1 ATP ملغ ، 0.2 ملغ GTP ؛ يتم ضبط درجة الحموضة في ~ 7.3 مع NMG - OH ، ويتم ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~.
4. آغار مساندة لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة منخفضة agarose التبلور تحتوي على شبكية العين (5 ٪ بالوزن) ، 7.5 غرام من آجار (سيغما ؛ القط # A7002) ذاب في 150 مل من DH ₂ O.

3. يوم للتجربة

1. ذوبان الجليد ~ 1.5 مل من محلول الداخلية K - ASP وfluorophore من اختيارك من الثلاجة. تمييع fluorophore إلى تركيز المناسبة ، التي ينبغي أن تحدد تجريبيا.
2. صب سائل الإعلام أميس "التي تحتوي على NaHCO ₃ (~ 200 مليلتر) في حاوية تخزين ضوء ضيق المكان ومن ثم الى حمام الماء (30-32 درجة مئوية) ، وتتوازن مع 5 ٪ CO ₂ / 95 ٪ O ₂ الغاز
3. ملء زجاجة مع مل 110 ~ وسائل الإعلام أميس "التي تحتوي على HEPES ، وضعها على الجليد ، وتتوازن مع 100 ٪ O _2.
4. المكان المتبقية أميس "التي تحتوي على وسائل الاعلام NaHCO ₃ في خزان ساخنة على رأس قفص فاراداي ، وتتوازن مع 5 ٪ CO ₂ / 95 ٪ O غاز _2. ويمكن استخدام Parafilm إلى اعتراض الغاز في الفضاء فوق الحل.
5. إعداد درجة حرارة منخفضة agarose التبلور (3 ٪) وذلك بإضافة 0.75 غرام (سيغما ؛ القط # A0701) إلى 25 مل من وسائل الاعلام أميس 'مع HEPES والحرارة في حل ~ 115 درجة مئوية لصهر agarose. يحرك حتى الحل واضحة من دون فقاعات ، وتخزينها في حمام الماء (~ 42 درجة مئوية).
6. ملء ماصة تسجيل مع الحل K - ASP الداخلية والتحقق من طرف المقاومة.

4. تبدأ التجربة

1. الموت ببطء وإزالة الماوس بسرعة العينين باستخدام مقص منحنية. وينبغي استخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء لجميع الإجراءات لمنع تبييض صبغة بصرية.
2. ضع عينيك على قطعة من ورق الترشيح لمنعهم من المتداول ، واستخدام رقيقة شفرة مزدوجة من جانب ، وجعل فتحة في القرنية ، بينما عقد العين مع ملقط.
3. في أقرب وقت ثقب مقلة العين ، ونقل أنهم العين في صحن مليء أميس وسائل الاعلام ".
4. باستخدام فتحة في القرنية كمدخل ، يتم استخدام مقص لقطع صغيرة بعيدا عن الأجزاء المتبقية من القرنية ، وبعد ذلك يمكن إزالة العدسة والجسم الزجاجي. أن نكون حذرين في الشبكية لا تزال تعلق على فنجان العين ، وتخزين فنجان العين في الظلام بنسبة 32 في وسائل الإعلام أميس 'معايرتها مع 5 ٪ CO ₂ / 95 ٪ O ₂ درجة مئوية.

5. تشريح

1. Hemisect واحدة من eyecups وفصل الشبكية من الظهارة الصبغية الشبكية. إزالة حواف الشبكية للسماح للأنسجة الكذب مسطح.
2. استخدام الزجاج الصغيرة ماصة باستور مع لمبة اللاتكس لملء طبق بيتري 35 ملم مع آغار ذاب ، واسحب عبر ملقط من خلال آغار لاختبار مدى اتساقه.
3. عندما يمكنك أن تبدأ في رؤية آغار يصلب :
   1. نقل الشبكية الى أعلى آغار.
   2. استخدام قطعة من Kimwipe الملتوية لامتصاص فائض حل حول الشبكية.
   3. مكان 2-3 قطرات من آجار مباشرة على شبكية العين والمكان بسرعة اسطوانة من البلاستيك في الشبكية لتشكيل جدار حوله. ثم أغار بالتنقيط ذاب إضافية أسفل جانبي اسطوانة بلاستيكية في حين تتمحور الشبكية داخل آغار.
   4. نقل طبق بيتري رس حمام ماء مثلج لتبرد.
4. ~ بعد 45 ثانية إزالة الأنسجة من الجليد حمام المياه واستخدام المكبس لبثق آغار كتلة من اسطوانة بلاستيكية ، ودفع من الجانب الأبعد من شبكية العين.
5. استخدام شفرة حلاقة من جانب واحد لقطع صغيرة من كتلة أجار يحتوي على شبكية العين وsuperglue كتلة في مكانه ضد مساندة أغار على القرص العينة.
6. نقل القرص العينة إلى علبة مشراح تهتز وتصب الثلج الباردة HEPES أميس في درج السماح للكتلة مع submersed الشبكية تماما.
7. ويمكن خفض الشرائح الشبكية مع سمك ميكرومتر 200 ~ بمعدل النصل الأقصى تهتز وسرعة شفرة قدما مجموعة من النوع الذي يأخذ 4 إلى 5 ثوان لقطع طريق شبكية العين على كل شريحة.
8. استخدام شفرة مشرط رقم 11 لإزالة كل شريحة واحدة قابلة للاستخدام في وقت
9. توضع شرائح جيدة تحتوي على شبكية العين في تسجيل والغرف هي المرجحة إلى أسفل مع شريحة المراسي مع خيوط النايلون عبور لهم. خيوط النايلون باستمرار آغار المحيطة شبكية العين ، وترك الشبكية دون عائق للتسجيلات.
10. نقل غرفة تسجيل لمرحلة المجهر تستقيم ، إغلاق الستائر وتشغيل مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء لعرض شريحة على كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة.

6. تسجيل

1. وحالما يتم التعرف على شريحة جيدة الشبكية (مع مبصرات سليمة وزاوية القطع المناسبة) تبدأ perfusing الشبكية بمعدل أكبر من 5 مل / دقيقة مع وسائل الاعلام أميس ساخنة "التي يتم تسخينها إلى 35 37 درجة مئوية ، ومعايرتها مع 5 ٪ CO ₂ / 95 ٪ O _2.
2. قد تكون بعض الأضرار السطحية تكون واضحة بسبب عملية تشريح. ويمكن إزالة هذه الطبقة رقيقة من الخلايا عادة باستخدام ماصة مع طرف مكسورة ، وامتصاص بلطف بعيدا الهيئات خلية ميتة. هذا وسوف تكشف عادة الخلايا الحية تحتها. التعرف على خلايا الجسم السليمة التي الموقف الموجود في طبقات الفائدة.
3. ملء micropipette مع الحل الداخلي وتطبيق KAsp الايجابية (الخارج) من خلال الضغط غيض من ماصة ، وانخفاض غيض من ماصة الى غرفة تسجيل وصولا الى مستوى الخلية باستخدام micromanipulator.
4. تحرك غيض ماصة مثل هذه الدمامل أن غشاء الخلية ، وتطبيق لطيف السلبية (الداخل) لضغوط لتقديم ختم مقاومة عالية. لا يمكن أن يتحقق خلية كاملة من خلال تطبيق طريقة الضغط السالب إلى القطب لكسر في الخلية.
5. يمكن تحفيز الأنسجة الشبكية باستخدام المصابيح تثير ردود ثم الى النور.
6. صورة من الخلية التي تم فيها التسجيل عن طريق إثارة مضان من fluorophore في حل ماصة الداخلية.

7. ممثل النتائج

الشكل 1 ، وهنا استحضر ضوء إمكانات مظلم مكيفة وأظهرت الخلايا العصبية للشبكية ومضات من الضوء على القوة المتزايدة.

الشكل 2. صورة من الإسفار شريحة الشبكية حيث تم ملء الخلايا مع fluorophore ، وسيفر الاصفر. مضان أثار يوضح مورفولوجيا الخلايا من التسجيلات التي أدلى التصحيح.

Discussion

وقد بذلت تسجيل شريحة من شبكية العين الفقارية لعقود ^1،2 ، وكانت ناجحة جدا في توفير فهم أعمق لكيفية عمل الدوائر الشبكية بترميز ضوء الحادث. مزايا القطع مع مشراح تهتز بدلا من مباشرة مع شفرة الحلاقة هو أن تكبد الشرائح الشبكية أقل ضررا على السطح. ماصة مع شفط فمن السهل أن إزالة هذا الضرر والخلايا المستهدفة صحية فقط تحت السطح التي تحتفظ التواصل فيما بينها في الدائرة الشبكية ، حيث تم التعرف على معظم أنواع الخلايا ^5،6 ، وأنه عرض ردود قوية الضوء. وبالتالي يمكن أن التسجيلات المشبك التصحيح من الظلام مكيفة شرائح الشبكية تسمح لمحققي لتحديد الأدوار التي تقوم بها الطبقات الخلايا العصبية التي تم تحديدها في العمليات الحسابية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781