Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Summary

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Abstract

Onze visuele ervaring wordt gestart wanneer de visuele pigment in ons netvlies fotoreceptoren fotonen van licht energie absorbeert en initieert een cascade van intracellulaire gebeurtenissen die leiden tot sluiting van cyclisch-nucleotide-gated kanalen in het celmembraan. De resulterende verandering in de membraanpotentiaal leidt weer tot vermindering van de hoeveelheid van de neurotransmitter release van zowel de staafjes en kegeltjes synaptische terminals. Om te meten hoe het licht opgewekte verandering in fotoreceptor membraanpotentiaal leidt tot downstream activiteiten in het netvlies, hebben wetenschappers gemaakt elektrofysiologische opnames van het netvlies slice de voorbereidingen voor tientallen jaren ^1,2. In het verleden zijn deze schijfjes zijn hand gesneden met een scheermesje op het netvlies weefsel dat wordt gehecht aan papieren filter, in de afgelopen jaren een andere methode van in plakken snijden is ontwikkeld, waarbij het netvlies weefsel is ingebed in een lage temperatuur gelering agar en in plakjes gesneden op een koele oplossing met een trillende microtoom ^3,4. Deze voorbereiding maakt het netvlies plakken met minder beschadiging van het oppervlak en zeer robuust licht-geëvoceerde responsen. Hier hebben we document hoe deze procedure kan worden gedaan onder infrarood licht om te voorkomen dat het bleken van de visuele pigment.

Protocol

1. Voorbereiden Elektroden

1. Bereid de opname-en referentie-elektroden door dompelen ze beide in 1 M NaCl en het rijden 15V tussen ze met behulp van een 1 Hz sinusgolf voor ~ 20 s.
2. Maak de registrerende elektroden met behulp van een micropipet trekker (Sutter Instrumenten P-97). Voor de patch-pipetten gebruiken een borosilicaatglas met een buitendiameter van 1,2 mm en een inwendige diameter van 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Meet de serie weerstand via de punt van de elektrode. Op basis van de grootte van de doelcellen kies een pipet tip diameter, voor de cellichamen ~ 20 micrometer in diameter gebruik ~ 5 MΩ voor cellichamen ~ 5 micrometer in diameter gebruik ~ 12 MΩ.
3. Bereid de grond / referentie-elektroden. Behulp van een injectiespuit te vullen een klein gedeelte polyethyleen buis (Intramedic, PE205) met 1 mM NaCl, dat 3,5% Agar bevat (Sigma, Cat # A7002) in 1 M NaCl. Plaats deze agar brug over de Ag / AgCl referentie-elektrode.

2. Voorbereiden Solutions

1. Externe bad oplossing, Ames 'media die Bicarbonaat (1 L): 1 fles van Ames' Medium (Sigma, Cat # A1420), 1,9 g NaHCO _3, 7 ml penicilline-streptomycine (Sigma, Cat # P0781) om te voorkomen dat bacteriën groei. Stel osmolariteit tot ~ 280 mOsm.
2. Snijden oplossing, Ames 'media die de pH buffer HEPES (1 L): 1 fles van Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml penicilline-streptomycine. Breng de pH op 7,4 met behulp van ~ 1M NaOH en / of 1M HCl. Stel osmolariteit tot ~ 280 mOsm.
3. Kalium-aspartaat (K-Asp) pipet interne oplossing (in mm): 125 K-aspartaat, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, een ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH wordt aangepast aan ~ 7.3 met NMG-OH, en de osmolariteit wordt aangepast aan ~ 280 mOsm.
4. Agar backstop voor het stabiliseren van een lage temperatuur gelering agarose met het netvlies (5% van het gewicht), 7,5 g agar (Sigma, Cat # A7002), gesmolten in 150 ml dH ₂ O.

3. Dag van Experiment

1. Dooi ~ 1,5 ml K-Asp interne oplossing en de fluorofoor van uw keuze uit de vriezer. Verdun de fluorofoor naar de juiste concentratie, die empirisch moeten worden bepaald.
2. Giet Ames 'media met NaHCO ₃ (~ 200 ml) in de lichtdichte opslagcontainer en plaats in het waterbad (30-32 ° C) en evenwicht met 5% CO ₂ / 95% O ₂ gas
3. Vul de fles met ca. 110 ml van Ames 'media met HEPES, plaats op ijs en evenwicht met 100% O _2.
4. Leg de rest van Ames 'media met NaHCO ₃ in een verwarmde reservoir boven op de kooi van Faraday, en evenwicht met 5% CO ₂ / 95% O ₂ gas. Parafilm kan worden gebruikt om het gas val in de ruimte boven de oplossing.
5. Bereid de lage temperatuur geleermiddel agarose (3%) door de toevoeging van 0,75 g (Sigma, Cat # A0701) tot 25 ml van Ames 'media met HEPES en warmte van de oplossing bij ~ 115 ° C om de agarose smelten. Roer tot de oplossing helder, zonder bubbels, en op te slaan in een waterbad (~ 42 ° C).
6. Vul een opname pipet met de K-Asp interne oplossing en controleer de tip weerstand.

4. Begin Experiment

1. Euthanaseren de muis en snel te verwijderen van de ogen met behulp van gebogen schaar. Infrarood bril moet worden gebruikt voor alle procedures om te voorkomen dat bleken van de visuele pigment.
2. Zet de ogen op een stuk filtreerpapier om te voorkomen dat rollen, en het gebruik van een dunne dubbelzijdige mes, maak een spleet in het hoornvlies terwijl het oog met de tang.
3. Zodra de oogbol is geperforeerd, transfer ze oog in een schaal gevuld met Ames 'media.
4. Met behulp van de spleet in het hoornvlies als een entry point, zijn kleine schaar gebruikt om weggesneden de overige delen van het hoornvlies, waarna de lens en het glasvocht verwijderd kan worden. Zorg ervoor dat het netvlies blijft verbonden aan de oogklep, en bewaar de oogschelp in het donker bij 32 ° C in Ames 'media in evenwicht gebracht met 5% CO ₂ / 95% O _2.

5. Snijden

1. Hemisect een van de oogschelpen en dissocieren het netvlies van de retina pigment epitheel. Verwijder de randen van het netvlies, zodat het weefsel om plat te liggen.
2. Gebruik een kleine glazen Pasteur pipet met een latex lamp aan een 35 mm petrischaal met gesmolten agar te vullen, en sleep de tang dwars door het agar om de consistentie te testen.
3. Wanneer je kunt beginnen te zien van de agar stollen:
   1. Overdracht van het netvlies naar de top van de agar.
   2. Gebruik een verdraaid stuk Kimwipe om de overtollige oplossing te absorberen rond het netvlies.
   3. Plaats 2-3 druppels van Agar direct op het netvlies en snel een plastic cilinder plaats over het netvlies een muur omheen te vormen. Dan druppelen extra gesmolten agar aan de zijkanten van de kunststof cilinder, terwijl het centreren van het netvlies in het agar.
   4. Breng de petrischaal to een ijswaterbad om af te koelen.
4. Na ~ 45 seconden verwijdert het weefsel van het ijs waterbad en gebruik een zuiger voor de extrusie van de agar uit blok van de kunststof cilinder, duwen van de kant die het verst van het netvlies.
5. Gebruik de eenzijdige scheermesje te snijden een kleine blok van agar met het netvlies en het blok secondelijm op zijn plaats tegen de agar terugloopblokkering op het monster disc.
6. Het analysemonster disc naar de vibrerende microtoom lade en giet ijskoud Ames HEPES in de lade zodat het blok met netvlies volledig worden ondergedompeld.
7. Netvlies plakken met een dikte van ~ 200 urn kan worden gesneden bij de maximale mes trillende snelheid en een voorwaartse bladsnelheid zodanig ingesteld dat het 4 tot 5 seconden duurt om dwars door het netvlies van elke plak.
8. Gebruik een nr. 11 scalpel op elk plakje een bruikbaar te verwijderen op een moment
9. Goede schijfjes bevatten netvlies worden geplaatst in het opnemen van kamers en worden gewogen neer met slice ankers met nylon draden kruisen. De nylon draden houd de agar rond het netvlies, waardoor het netvlies vrij voor de opnames.
10. Breng de opname kamer tot de fase van de rechtopstaande microscoop, sluit het gordijn en zet de infrarood lichtbron om de slice visie op een infrarood-gevoelige camera.

6. Opname

1. Zodra een goede netvlies slice (met intacte fotoreceptoren en de juiste snijhoek) wordt geïdentificeerd beginnen perfuseren het netvlies met een snelheid van meer dan 5 ml / min met een verwarmd Ames 'media die is verwarmd tot 35 37 ° C en in evenwicht met 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. Sommige beschadigingen van het oppervlak kan worden duidelijk als gevolg van het snijden proces. Dit meestal dunne laag van cellen kan worden verwijderd met behulp van een pipet met een gebroken tip, en voorzichtig wegzuigen de dode cellichamen. Dit zal meestal onthullen levende cellen eronder. Identificeer een gezonde cel lichaam waarvan de positie is gelegen in de lagen van belang.
3. Vul een micropipet met de KAsp interne oplossing en toe te passen positief (naar buiten) druk door de punt van de pipet, en laat de punt van de pipet in de opname kamer en tot op het niveau van de cel met behulp van een micromanipulator.
4. Verplaats de pipetpunt zodanig dat het de celmembraan kuiltjes, en zachtjes negatief (naar binnen) druk om een ​​hoge weerstand afdichting te maken. Whole-cell-modus kan worden bereikt door toepassing van negatieve druk op de elektrode in te breken in de cel.
5. Het stimuleren van de retinale weefsel met behulp van LED's kunnen dan roepen reacties op licht.
6. Foto van de cel van waaruit de opname is gemaakt door oproepen van fluorescentie van de fluorofoor in de pipet interne oplossing.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. Hier, licht-evoked potentials van een donker aangepaste netvlies neuron tot flitsen van het licht van de toenemende kracht worden getoond.

Figuur 2. Fluorescentie afbeelding van een schijfje waar de retina cellen zijn gevuld met de fluorofoor, Lucifer Yellow. Evoked fluorescentie toont de morfologie van de cellen waaruit patch opnamen zijn gemaakt.

Discussion

Snijd de opname van gewervelde netvliezen zijn gemaakt voor tientallen jaren ^1,2, en zijn redelijk succesvol in het verstrekken van een dieper begrip van hoe de retinale circuits codeert invallende licht. De voordelen van het snijden met een trillende microtoom in plaats van rechtstreeks met een scheermesje is dat het netvlies plakken minder schade aan het oppervlak oplopen. Met een zuigkracht pipet is het gemakkelijk te verwijderen deze schade en doel gezonde cellen net onder de oppervlakte die hun connectiviteit te behouden in de retinale circuit, waar de meeste van de cel types zijn geïdentificeerd ^5,6, en dat tonen robuust reacties licht. Zo patch clamp opnames van donker aangepaste netvlies plakken kan toestaan ​​dat een onderzoeker aan het rollen door de aangewezen cel klassen in neurale berekeningen te bepalen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781