Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Summary

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Abstract

Bizim görsel deneyim retinal fotoreseptör görsel pigment fotonlar, ışık enerjisini emer ve hücre zarı siklik nükleotid kapılı kanallar kapatılmasına yol açan hücre içi olaylar zincirini başlatır zaman başlatılır. Membran potansiyeli ortaya çıkan değişiklik çubuk ve koni sinaptik terminalleri hem de nörotransmitter serbest miktarda azalma sırayla açar. Fotoreseptör membran potansiyeli ışık uyarılmış değişiklik retinada aşağı aktiviteye yol açar nasıl ölçmek için, bilim adamları onlarca yıl ^1,2 retina dilim hazırlıkları elektrofizyolojik kayıtlar yaptık. Geçmişte bu dilimleri elle filtre kağıdı bağlı retina dokusunun bir jiletle kesilmiş; son yıllarda dilimleme başka bir yöntem, retina dokusunun düşük jelleşme sıcaklığı agar sayede gömülü geliştirilmiştir ve soğuk çözüm dilimlenmiş mikrotom titreşimli ^3,4. Bu preparat ile retina dilimleri daha az yüzey hasarı ve çok sağlam bir ışık uyarılmış yanıtlar üretir. Burada bu yordamı görsel pigment beyazlatma önlemek için kızıl ötesi ışık altında nasıl yapılacağı belge.

Protocol

1. Hazırlanması Elektrotlar

1. 1M NaCl hem daldırma ve aralarında sürüş 15V ~ 20 sn için 1 Hz sinüs dalga kullanarak kayıt ve referans elektrotlar hazırlayın
2. Mikropipet çektirmesi (Sutter Aletleri P-97) kullanarak kayıt elektrotları olun. Patch-pipetler, dış çapı 1.2 mm ve iç çapı 0.69 mm (Sutter Instruments, Kedi # B120-69-10) bir ile borosilikat cam kullanın. Elektrodun ucu ile seri direnci ölçün. M ~ 12 ~ 5 hücreli organları için M ~ (5) mm çaplı kullanımının cep organları için ~ 20 mm çaplı kullanımı yapısı bir pipet ucu çapı seçin hedef hücrelerin büyüklüğüne göre.
3. / Referans elektrot zemin hazırlayın. 1M NaCl; bir şırınga kullanarak (Cat # A7002 Sigma),% 3.5 Agar 1 mM NaCl ile küçük bir bölümü polietilen boru (Intramedic PE205) doldurmak. Ag / AgCl referans elektrot üzerinden bu agar köprüsü yerleştirin.

2. Hazırlanması Çözümler

1. Harici banyo çözümü, Ames Bikarbonat (1 L) içeren medya: Ames 1 şişe 'Orta (Sigma; Kedi # A1420), 1,9 g NaHCO _3, Penisilin-Streptomisin 7 mL (Sigma; Kedi # P0781) bakteriyel önlemek için büyüme. ~ 280 mOsm ozmolarite ayarlayın.
2. Çözüm Dilimleme Ames pH tampon Hepes (1 L) içeren ortam: 1 şişe Ames 'Orta, 0.887 g NaCl, 2.38 g Hepes, 7 ml Penisilin-Streptomisin. 1M NaOH ve / veya 1M HCl ~ 7.4 pH ayarlayın. ~ 280 mOsm ozmolarite ayarlayın.
3. Potasyum Aspartat (K-Asp) pipetle iç çözeltisi (mM): 125 K-Aspartat, 10 KCl, 10 Hepes, 5 NMG HEDTA, 0.5 CaCl 1, ₂ ATP-Mg, 0.2 GTP-Mg; pH ayarlanır. ~ 7.3 NMG-OH ve ozmolarite ~ 280 mOsm ayarlanır.
4. Retina içeren jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (ağırlıkça% 5), 7.5 g Agar (Sigma; Cat # A7002) stabilize Agar döndürmez kilit _{dH 2} O, 150 mL erimiş

3. Deney günü

1. Çözülme ~ 1.5 ml K-Asp İç Çözüm ve dondurucu seçtiğiniz fluorofor. Ampirik olarak tespit edilmelidir uygun konsantrasyon, fluorofor sulandırınız.
2. Ames (30-32 ° C) su banyosu içine ışık geçirmez saklama kabı ve yerine içine NaHCO ₃ (~ 200 ml) içeren medya dökün ve% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ gaz dengelenmesi
3. Ames 'medya Hepes yer buz içeren yaklaşık 110 mL şişe doldurun ve% 100 O ₂ ile dengelenmesi.
4. Faraday kafesinin üstüne ısıtılmış bir rezervuar NaHCO ₃ içeren diğer Ames 'medya yerleştirin ve% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ gazı ile dengelenmesi. Parafilm çözüm yukarıdaki boşluk gaz yakalamak için kullanılabilir.
5. Jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (% 3); (Cat # A0701 Sigma) 0.75 g, Hepes ve ısı ~ 115 ° C agaroz eritmek için çözüm ile Ames 'medya 25 ml ekleyerek hazırlayın. Kabarcıkları olmadan net, bir su banyosu ve mağaza çözümü kadar karıştırın (~ 42 ° C).
6. K-Asp iç solüsyonu ile doldurun ve bir kayıt pipet ucu direnci kontrol edin.

4. Deney başlayın

1. Fare Euthanize ve hızlı bir şekilde gözler kavisli makas kullanarak kaldırın. Kızılötesi gözlük görsel pigment beyazlatma önlemek için tüm işlemleri için kullanılmalıdır.
2. Forseps ile göz tutarken gözleri filtre kağıdı, haddeleme, ve ince bir çift taraflı bıçak kullanarak onları önlemek için bir parça yerleştirin, kornea bir yarık.
3. Göz küresi delinmiş olduğu gibi, bunlar göz Ames 'medya ile dolu bir çanak içine aktarın.
4. Bir giriş noktası olarak kornea yarık, küçük bir makas, kornea, lens ve vitreus silinebilir sonra geri kalan kısımları kesip kullanılır. Retina Göz yuvası takılı kalır ve 32 karanlıkta Göz yuvası saklamak ° C,% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ ile dengelenmiş Ames medya dikkatli olun.

5. Dilimleme

1. GÖZ KAPAKLARI Hemisect retina ve retina pigment epiteli ayrıştırmaları. Doku düz yalan izin retinanın kenarlarını çıkarın.
2. Erimiş agar ile 35 mm Petri kabı doldurmak için küçük bir bardak Pasteur pipeti lateks bir ampul kullanın ve tutarlılığını test etmek için forseps agar yoluyla boyunca sürükleyin.
3. Agar katılaşmaya başlar.
   1. Agar üst retina aktarın.
   2. Retina çevresinde aşırı bir çözüm emmek için çarpık bir Kimwipe parçası kullanın.
   3. Yeri 2-3 Agar doğrudan retinanın üzerine düşer ve hızlı bir şekilde etrafına bir duvar oluşturmak için retina üzerinde plastik bir silindir. Agar içinde retinanın merkezleme Sonra plastik silindir tarafı aşağı ek erimiş agar damla.
   4. Petri kabı t transfero serin bir buzlu su banyosu.
4. ~ 45 saniye buzlu su banyosu doku kaldırmak ve agar retinanın en uzak tarafında iterek, plastik silindir bloğu a'ya bir dalgıç kullandıktan sonra.
5. Agar içeren retinanın küçük bir blok kesme ve numune disk agar Geri döndürmez kilit karşı blok superglue tek taraflı jileti kullanın.
6. Titreşimli mikrotom tepsi örnek diske aktarın ve buz Ames Hepes retina ile blok tam olarak temas etmesini sağlayan tepsiye dökün.
7. Retina dilim ~ 200 mikron kalınlığında kesilmiş ve maksimum bıçak titreşimli hızında ileri bir bıçak hızı retina her dilim kesmek için 4 ila 5 saniye sürer gibi ayarlanabilir.
8. No: 11 neşter bıçak, her bir seferde kullanılabilir dilim kaldırmak için kullanın.
9. İyi dilimleri içeren retina kayıt odaları yerleştirilir ve onları geçiş naylon konuları dilim çapa ile ağırlıklı. Naylon konuları kayıtlar için engelsiz retina bırakarak, retina çevreleyen agar basılı tutun.
10. Sahneye dik mikroskop Transfer kayıt odası, perde kapatmak ve hassas bir kızılötesi kamera dilim görüntülemek için kızılötesi ışık kaynağı açın.

6. Kayıt

1. Bir iyi bir retina dilim (sağlam fotoreseptör ve uygun kesme açısı ile) hızında retina perfüze başlamak tanımlanan 35 37 ısıtılır ısıtılır Ames 'medya ile daha fazla 5 ml / dak ° C ve% 5 _CO 2 ile dengelenmiş /% 95 O _2.
2. Bazı yüzeyine zarar dilimleme işlemi nedeniyle ortaya çıkabilir. Bu genellikle ince bir tabaka hücreleri kırık bir ucu ile bir pipet kullanarak kaldırılır ve nazikçe ölü hücre gövdeleri uzak emme olabilir. Bu genellikle canlı hücreler altında ortaya koyacaktır. Pozisyonu ilgi katmanlarda bulunan sağlıklı bir hücre gövdesi belirleyin.
3. Mikropipet KAsp iç solüsyonu ile doldurun ve pipet ucu ile pozitif (dışa doğru) basınç uygular ve bir micromanipulator kullanarak hücre düzeyine kayıt odasına pipet ucu düşük.
4. Hücre zarı gamzeler gibi pipet hareket ettirin ve yüksek bir direnç mühür yapmak için nazik negatif (içe) basınç uygulayın. Tüm hücre modunda hücre içine kırmak için elektrot negatif basınç uygulayarak elde edilebilir.
5. LED'leri kullanarak retina dokusunun Uyarıcı ışık tepkiler uyandırabilir.
6. Pipetle iç çözüm fluorofor floresan çağrıştıran kayıt yapıldığı hücre Fotoğraf.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 Burada, karanlık bir adapte artan gücü ışık çakmaları retina nöron gösterilmiştir potansiyelleri ışık uyarılmış.

Şekil 2 florofor Lucifer Sarı hücreleri ile dolu olduğu bir retina dilim Floresan resim. Uyarılmış floresan yama kayıtları yapıldığı hücrelerinin morfolojisi gösterir.

Discussion

Omurgalı retina Dilim kayıt onlarca yıl ^1,2 için yapılmış ve retina devre olay ışık kodlar nasıl daha derin bir anlayış sağlama konusunda oldukça başarılı olmuştur. Titreşen bir mikrotom kesim yerine doğrudan daha bir jilet ile avantajları, retina dilimler yüzeyinde daha az hasar tabi ki. Emme pipet ile sadece hücre tipleri en çok ^5,6 tespit edilmiştir retina devre, bağlantı korumak yüzeyinin altında bu hasar ve hedef sağlıklı hücreleri çıkarmak için kolay ve bu görüntü sağlam yanıtları ışık. Bu nedenle koyu adapte retina dilim yama kelepçe kayıtları, sinir hesaplamaları tespit hücre sınıflar tarafından oynanan roller belirlemek için bir araştırmacı izin verebilirsiniz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781