Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l'obscurité Slice

Summary

Nous décrivons ici une procédure pour générer adaptés à l'obscurité des tranches de la rétine de souris pour les enregistrements électrophysiologiques.

Abstract

Notre expérience visuelle est déclenchée lorsque le pigment visuel dans nos photorécepteurs rétiniens absorbe les photons d'énergie de la lumière et déclenche une cascade d'événements intracellulaires qui conduisent à la fermeture de nucléotide cyclique-dépendants des canaux dans la membrane cellulaire. Le changement résultant dans le potentiel de membrane entraîne à son tour une réduction du montant de la libération des neurotransmetteurs à la fois de la tige et les terminaux cône synaptique. Pour mesurer la façon dont le changement de lumière évoquée dans le potentiel de membrane des photorécepteurs conduit à une activité en aval dans la rétine, les scientifiques ont fait des enregistrements électrophysiologiques de préparations tranche de la rétine pour ^1,2 décennies. Dans le passé, ces tranches ont été coupées manuellement avec une lame de rasoir sur le tissu rétinien qui est attaché à un papier filtre; ces dernières années une autre méthode de découpage a été développé selon lequel le tissu rétinien est intégré dans l'agar gélifiant à basse température et tranchées dans une solution fraîche avec un vibrant microtome ^3,4. Cette préparation produit des tranches de la rétine avec moins de dommages de surface et des réponses très robuste lumière évoquée. Ici nous montrons comment cette procédure peut être faite sous une lumière infrarouge pour éviter le blanchiment du pigment visuel.

Protocol

1. Électrodes Préparation

1. Préparer les électrodes d'enregistrement et de référence en les trempant dans deux 1M de NaCl et de conduite 15V entre eux utilisant une onde sinusoïdale de 1 Hz pour ~ 20 s.
2. Faire les électrodes d'enregistrement à l'aide d'un tire-micropipette (Sutter Instruments P-97). Pour les pipettes de patch-utiliser un verre borosilicate avec un diamètre extérieur de 1,2 mm et un diamètre intérieur de 0,69 mm (Sutter Instruments, Cat # B120-69-10). Mesurer la résistance série à travers la pointe de l'électrode. Basé sur la taille des cellules cibles choisir un diamètre de pointe de la pipette, car les corps cellulaires ~ 20 um d'utilisation diamètre ~ 5 MW pour les corps cellulaires ~ 5 um d'utilisation de diamètre ~ 12 MQ.
3. Préparez-chaussée / électrodes de référence. En utilisant une seringue de remplir un tube en polyéthylène petite section (Intramedic, PE205) avec 1 mM de NaCl qui comprend Agar 3,5% (Sigma, Cat # A7002) dans NaCl 1M. Placez ce pont agar sur l'électrode de référence Ag / AgCl.

2. La préparation de solutions

1. Solution du bain externe, «les médias contenant du bicarbonate (1 L): 1 bouteille de Ames Ames Moyenne (Sigma, Cat # A1420), 1,9 g de NaHCO _3, 7 ml de pénicilline-streptomycine (Sigma, Cat # P0781) pour empêcher des bactéries la croissance. Ajustez l'osmolarité à ~ 280 mOsm.
2. Tranchage solution, «support contenant le tampon HEPES pH (1 L): 1 bouteille de Ames Ames moyen, 0,887 g de NaCl, 2,38 g d'HEPES, 7 ml de pénicilline-streptomycine. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant ~ 1M NaOH et / ou HCl 1M. Ajustez l'osmolarité à ~ 280 mOsm.
3. Potassium-aspartate (K-Asp), pipeter solution interne (en mM): 125 K-aspartate, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 _CaCl2, une ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg; pH est ajusté à ~ 7.3 avec NMG-OH, et l'osmolarité est ajusté à ~ 280 mOsm.
4. Filet Agar pour la stabilisation de basse température de gélification agarose contenant de la rétine (5% en poids), 7,5 g d'Agar (Sigma, Cat # A7002) fondu dans 150 ml de dH ₂ O.

3. Journée de l'expérience

1. Dégel ~ 1,5 ml de K-Asp solution interne et le fluorophore de votre choix du congélateur. Diluer le fluorophore à la concentration appropriée, qui doit être déterminée empiriquement.
2. Verser les médias Ames contenant NaHCO ₃ (~ 200 ml) dans le conteneur de stockage étanche à la lumière puis placez-le dans le bain d'eau (30-32 ° C) et s'équilibrer avec 5% de CO ₂ / 95% d'O ₂ du gaz
3. Remplissez la bouteille avec ~ 110 mL de milieu d'Ames contenant HEPES, placer sur la glace et équilibrer avec 100% d'O _2.
4. Placez le support restant Ames contenant NaHCO ₃ dans un réservoir chauffé au-dessus de la cage de Faraday, et s'équilibrer avec 5% de CO ₂ / 95% d'O ₂ du gaz. Parafilm peut être utilisé pour piéger le gaz dans l'espace ci-dessus la solution.
5. Préparer la faible température de gélification agarose (3%) en ajoutant 0,75 g (Sigma, Cat # A0701) à 25 ml de milieu d'Ames »avec HEPES et chauffer la solution à ~ 115 ° C pour faire fondre l'agarose. Remuer jusqu'à ce que la solution claire, sans bulles, et stocker dans un bain d'eau (~ 42 ° C).
6. Remplir une pipette d'enregistrement avec la solution K-Asp interne et vérifier la résistance de pointe.

4. Commencez l'expérience

1. Euthanasier la souris et supprimer rapidement les yeux avec des ciseaux courbes. Des lunettes à infrarouge doit être utilisé pour toutes les procédures visant à prévenir le blanchiment du pigment visuel.
2. Placez les yeux sur un morceau de papier filtre pour les empêcher de rouler, et en utilisant un mince lame à double face, faire une fente dans la cornée de l'œil tout en maintenant avec la pince.
3. Dès le globe oculaire est percé, le transfert de leur oeil dans un plat rempli de média Ames.
4. Utilisation de la fente de la cornée comme un point d'entrée, petits ciseaux sont utilisés pour couper les portions restantes de la cornée, après quoi le cristallin et du vitré peut être enlevé. Veillez à ce que la rétine reste attaché à l'œilleton, et de stocker l'œilleton dans l'obscurité à 32 ° C dans les médias équilibrée avec 5% de CO ₂ / 95% O ₂ Ames.

5. Tranchage

1. Hemisect l'un des œilletons et dissocier la rétine de l'épithélium pigmentaire rétinien. Retirer les bords de la rétine afin de permettre le tissu à plat.
2. Utilisez une petite pipette Pasteur en verre avec une ampoule de latex pour remplir un plat de Pétri de 35 mm avec de l'agar fondu, et faites glisser la pince travers grâce à l'agar-agar pour tester sa cohérence.
3. Lorsque vous pouvez commencer à voir la gélose se solidifier:
   1. Transfert de la rétine au sommet de l'agar-agar.
   2. Utilisez un morceau tordu de Kimwipe pour absorber l'excès de solution autour de la rétine.
   3. Placer 2-3 gouttes d'Agar directement sur la rétine et de placer rapidement un cylindre en plastique sur la rétine pour former un mur autour d'elle. Puis au goutte à goutte supplémentaires gélose fondue sur les côtés du cylindre en plastique tout en centrant la rétine dans l'agar.
   4. Transférer la boîte de Petri to un bain d'eau glacée pour se rafraîchir.
4. Après ~ 45 secondes enlever le tissu du bain d'eau glacée et l'utilisation d'un piston pour extruder la gélose de bloc hors du cylindre en plastique, poussant du côté le plus éloigné de la rétine.
5. Utilisez la lame de rasoir unilatérale de couper un petit bloc de gélose contenant de la rétine et la superglue le bloc en place contre la butée gélose sur la platine.
6. Transfert du disque spécimen sur le plateau vibrant microtome et versez glacée HEPES Ames dans le bac permettant le bloc avec la rétine pour être pleinement immergé.
7. Tranches de la rétine avec une épaisseur de ~ 200 um peut être coupé au taux maximum de la lame vibrante et une vitesse de lame vers l'avant ensemble tel que cela prend 4 à 5 secondes pour couper à travers la rétine sur chaque tranche.
8. Utilisez une lame de bistouri n ° 11 pour supprimer chaque une tranche utilisable à la fois
9. Bonne tranches contenant la rétine sont placés dans des chambres d'enregistrement et sont lestés avec des ancres tranche avec fils de nylon en les croisant. Le fils de nylon maintenez enfoncée la gélose entourant la rétine, laissant la rétine dégagée pour les enregistrements.
10. Transférer la chambre d'enregistrement de la platine du microscope debout, fermer le rideau et tourner sur la source de lumière infrarouge pour voir la tranche sur une caméra infrarouge sensible.

6. Enregistrement

1. Une fois une bonne tranche de rétine (avec des photorécepteurs intact et l'angle de coupe appropriée) est identifié commencent perfusant la rétine à un taux supérieur à 5 mL / min avec les médias chauffés Ames qui est chauffé à 35 37 ° C et équilibrée avec 5% de CO ₂ / 95% d'O _2.
2. Quelques dégâts de surface peut être apparente en raison du processus de tranchage. Cette couche généralement mince de cellules peuvent être retirés à l'aide d'une pipette avec une pointe cassée, et doucement sucer enlever les corps des cellules mortes. Ce sera généralement révèlent des cellules vivantes en dessous. Identifier un corps cellulaire saine, dont la position se situe dans les strates d'intérêt.
3. Remplir une micropipette avec la solution Kasp internes et d'appliquer positif (vers l'extérieur) de pression à travers la pointe de la pipette, et inférieure de la pointe de la pipette dans la chambre d'enregistrement et jusqu'au niveau de la cellule à l'aide d'un micromanipulateur.
4. Placez l'extrémité de la pipette de telle sorte qu'il fossettes de la membrane cellulaire, et appliquer doucement négatives (flux entrants) de pression pour faire un joint à haute résistance. Cellules entières mode peut être obtenu en appliquant une pression négative à l'électrode de pénétrer dans la cellule.
5. Stimuler le tissu rétinien utilisant des LED peut alors évoquer des réponses à la lumière.
6. Photographie de la cellule à partir de laquelle l'enregistrement a été réalisé en évoquant la fluorescence du fluorophore dans la pipette solution interne.

7. Les résultats représentatifs

Figure 1. Ici, la lumière des potentiels évoqués d'une adaptés à l'obscurité neurone rétinien d'éclairs de lumière de force croissante sont présentés.

Figure 2. Image de fluorescence d'une tranche où les cellules rétiniennes ont été remplis avec du fluorophore, Lucifer Yellow. Fluorescence évoqués montre la morphologie des cellules à partir desquelles des enregistrements de patch ont été faites.

Discussion

L'enregistrement tranche de rétines de vertébrés ont été faites depuis des décennies ^1,2, et ont assez bien réussi à fournir une compréhension plus profonde de la façon dont les circuits rétiniens encode la lumière incidente. Les avantages de la coupe avec un microtome vibrant plutôt que directement avec une lame de rasoir, c'est que les tranches de la rétine encourent moins de dégâts à la surface. Avec une pipette d'aspiration, il est facile d'enlever ces dommages et les cellules cibles saines juste en dessous de la surface qui conservent leur connectivité dans le circuit de la rétine, où la plupart des types de cellules ont été identifiés ^5,6, et que les réponses d'affichage robustes à la lumière. Ainsi les enregistrements de patch-clamp à partir adaptés à l'obscurité tranches rétinien peut permettre à un enquêteur de déterminer le rôle joué par les classes de cellules identifiées dans les calculs de neurones.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781