Summary
אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של האמרגן אנדוגני.
Abstract
לימפוציטים, כגון בתאי T, לעבור גנטי V (D) רקומבינציה J, כדי ליצור קולטן עם ייחוד מסוים 1. עבור העכברים הטרנסגניים מחדש אנטיגן ספציפי לקולטן תא T (TCR) היה כלי הכרחי ללמוד פיתוח פונקציה תא T ו. עם זאת, TCRs כאלה הם בדרך כלל מבודדים מתאי T רלוונטי אחרי התרבות לטווח ארוך לעתים קרובות בעקבות גירוי אנטיגן חוזרות ונשנות, אשר בוחר באופן בלתי נמנע עבור בתאי T עם זיקה גבוהה. שילוב גנטי אקראי של TCR α ו-β-שרשרת ביטוי שאינו אנדוגני מן היזמים יכולים להוביל שינויים ברמת הביטוי קינטיקה.
Reprogramming epigenetic באמצעות העברת גרעיני תאים סומטיים מספק כלי ליצירת תאים עובריים ועכברים מתא כל עניין. כתוצאה מכך, כאשר SCNT מוחל בתאי T של סגוליות ידוע, גנטיים אלה V (D) rearrangements J מועברים SCNT-בתאי גזע עובריים (ESCs) ואת העכברים הנגזרים מהם, בעוד סימני epigenetic מאופסות. אנחנו הוכיחו כי תאי T עם מוגדרים מראש ספציפיות נגד gondii Toxoplasma יכול לשמש ליצירת מודלים העכבר המבטאים את TCR ספציפיים לוקוסים אנדוגניים שלהם, ללא שינוי גנטי הציג בניסוי. הקלות המהירות היחסית שבה מודלים transnuclear כזה ניתן להשיג טומן בחובו הבטחה לבניית מודלים של מחלות אחרות.
Protocol
בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו Kirak et al. Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. בידוד של תאים התורם
לפני T ספציפיים או תאים B יכול לשמש תאים התורם ליצירת מודלים העכבר transnuclear, עכברים צריך להיות נגוע הפתוגן של עניין או שחוסנו עם אנטיגן של עניין. מאז השתמשנו בתאי CD8 + ספציפיים gondii Toxoplasma, פרוטוקול הבא יתאר את הדור ובידוד של תאים אלה צריך להיות מותאם על פי עניין אישי.
- ציסטות נגזר homogenate עכבר המוח (כ -40) מוזרקים peritoneally פנים אל BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) בעכברים, אשר מאפשרת בידוד של שני H-2 b ו-H-2 ד מוגבלת CD8 + T תאים.
- בשיאה של התגובה החיסונית, העכבר הוא נגוע מורדמים, הטחול מבודדים להציב לתוך תבשיל המכיל 6 תאים למ"ל דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה.
- שימוש הצדדים חלבית של שתי שקופיות כיסוי, הטחול הוא האדמה בזהירות מודגרות במאגר תמוגה RBC דקות 5 ב RT.
- הוסף 14 מ"ל PBS, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת התא (40 או 70 מיקרומטר) לתוך צינור בז 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דק 'ב 300 גרם.
- הסר supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל PBS ולהעביר לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 גרם ולהסיר את supernatant לאחר מכן.
- Resuspend התא גלולה ב 50 PBS μL, מוסיפים נוגדנים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את סוג התא של עניין (לדוגמה CD3, B220, CD8, ו CD4), ו שכותרתו fluorescently MHC-אני tetramer (MHC-II tetramer עבור תאים מסוג CD4 T) טעון עם הפפטיד לעניין ההשעיה התא דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- הוסף 1 מ"ל PBS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 גרם, resuspend גלולה ב 3 מ"ל PBS, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת התא (40 או 70 מיקרומטר) לתוך צינור.
- בצע FACSorting ידי קביעת השערים stringently (איור 1B).
2. העברת תאים סומטיים גרעיני
ישנם מספר פרוטוקולים עבור העברת תא סומטי גרעיני. האחד המתואר כאן עושה שימוש ביציות נעצר Metaphase-II ואת עיכוב של חלוקת meiotic שנייה על ידי שימוש ב Cytochalasin לכן יש צורך בתאי התורם אשר נמצאים בשלב G0/G1.
- הכנת ביציות
- עכברים נקבה רקע BDF1 מוזרקים peritoneally התוך עם 5IU PMS לכל עכבר 05:00-07:00.
- בערך 47 שעות לאחר מכן, כל עכבר מוזרק peritoneally התוך עם HCG 5IU.
- הכינו צלחת תרבות (KSOM-AA טיפות תחת שמן) עבור ביציות באותו יום כמו הזריקה HCG ומקום אותם באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. כמו כן, להכין את המחטים הכרחי SCNT (7μm עבור enucleation ו 4 או 5μm להעברת גרעיני של גרעיני לימפוציטים) על ידי טעינת אותם כספית.
- להרדים עכברים לבודד oviducts על 13h לאחר HCG (בערך 08:00). אסוף את oviducts ב 1-2 טיפות של HCZB.
- אחד על אחד להעביר את oviducts לתוך ירידה המכיל M2 w / Hyaluronidase. ניק oviduct בזהירות עם המלקחיים ולהעביר את הביצית, קומולוס, מורכבים לתוך הירידה. אחרי הכל הביצית, קומולוס, מתחמי להיות מבודדים, את המנה היא מודגרות ב 37 ° C.
- אחרי 2-5 דקות (הזמן המדויק תלוי אצווה של Hyaluronidase) לאסוף את ביציות, להתרחץ HCZB צלחת אותם KSOM-AA טיפות.
- Enucleation של ביציות
- השתמש את מכסה בצלחת פטרי כדי להכין את צלחת SCNT. הגדר את המיקרוסקופ, ואת micromanipulator.
- לשטוף את המחט enucleation (7 מיקרומטר) ב PVP לפני התחלת עם enucleation.
- עבור enucleation, במקום קבוצה של ביציות (10-30) תוך ירידה של HZCB עם Cytochalasin B (5 מיקרוגרם / מ"ל). בעוד דוגרים (מינימום 5 דקות) השורה למעלה ביציות אופקית.
- קח אחד הביצית ולמקם אותו מול המחט מחזיק. תקן את הביצית אל המחט מחזיק ידי החלת ואקום. באמצעות המחט enucleation, להפוך את הביצית עד מורכבים כרומוזום-ציר (CSC, המכונה לעתים קרובות את "גרעין") נמצא בעמדה 3 בצהריים.
- שימוש ב-piezo הדופק לחדור pellucida zona בזהירות מבלי לפגוע הביצית. מניחים את הפתיחה של מחט הסמוך לציר Metaphase-II ו להחיל ואקום. "גרעין" צריך לנוע באיטיות לתוך המחט, ואת הממברנה צריך לאטום את עצמו ברגע שהוא יוסר לחלוטין.
- מעבירים את ביציות enucleated בחזרה הטיפות KSOM-AA, לשטוף אותם מספר פעמים. חזור על הדוארנוקלאציה צעדים עם קבוצה חדשה של ביציות. המשך עד שכל הביצים enucleated או עד כ - 11:00.
- העברת גרעין
- בשביל להעביר את הגרעין, בתמורה את המחט enucleation (7 מיקרומטר) עם מחט העברת גרעיני (4 או 5 מיקרומטר) ולשטוף אותו עם PVP.
- המקום התאים העניין שלך (כגון תאים CD8 + T) לתוך ירידה עם PVP, מערבבים היטב דגירה למינימום של 10 דקות.
- מקום קבוצה של ביציות enucleated (10-30) תוך ירידה של HCZB עם Cytochalasin B (2.5 מיקרוגרם / מ"ל). בעוד דוגרים (מינימום 5 דקות) השורה למעלה ביציות אופקית באמצעות מחט העברת גרעיני.
- תרימי תא התורם מן ההשעיה-PVP התא לשאוב אותו-and-out עד הקרום החיצוני נשבר (שברים של הממברנה ואת cytosol צריך להיות גלוי). אם יש צורך piezo הדופק יכול להיות מיושם. לאחר גרעין כבר מבודדים, להזיז אותו קצת למעלה המחט, וממשיכים לאסוף את הגרעינים עד שיש לך 10-30.
- מעבר ירידה המכיל את ביציות enucleated מיושר. תקן one הביצית אל המחט מחזיק באמצעות החלת ואקום. מניחים את המחט העברת גרעיני (גרעינים צריך להיות במרחק הפתיחה) סמוך pellucida zona וליישם piezo הדופק עד שהמחט עברה את pellucida zona. בזהירות להזיז גרעין אחד אל קצה המחט, לדחוף את המחט לתוך הביצית עד קצה המחט היא 2 / 3 פנימה. החל לחץ שלילי קטן, כל כך מעט קרום הביצית נמצאת המחט.
- השלב הבא הוא מאוד קריטי, שכן הוא הזמן רק כאשר הביצית הוא למעשה "פתוח". החלת הדופק יחיד של piezo, לדחוף החוצה את הגרעין של המחט על ידי הפעלת לחץ חיובי, בזהירות למשוך בחזרה את המחט כך קצה הוא כ 1 / 3 בתוך הביצית, ולאחר מכן להפעיל לחץ שלילי ולהמשיך למשוך בחזרה את המחט לאטום את הביצית. חזור על שלב זה עם כל הביצית.
- אחרי הכל ביציות של קבוצת קיבלו גרעין, הם נשטפים תרבותי KSOM-AA התקשורת. חזור על נוהל זה עם ביציות כל.
- אחרי הקבוצה האחרונה כבר התרבויות KSOM-AA עבור מינימום של 30 דקות, SCNT-העוברים מועברים לתוך טיפות Ca ללא מדיה ההפעלה המכילה SrCl2.
- לאחר 6 שעות של הפעלה, בסכום של pronuclei מדומה (PPN) חיובי SCNT-העוברים נקבע. עוברים נשטפים אז בתרבית KSOM-AA טיפות עבור 3.5 ימים נוספים עד שהם הגיעו לשלב הבלסטוציסט.
- תרופות או כימיקלים של בחירה (כגון Trichostatin) ניתן להוסיף הפעלת התקשורת והתרבות.
3.Derivation בתאי גזע עובריים
SCNT-blastocysts ניתן להשתמש גם להעביר אותם פסאודו נשים בהריון (המכונה גם שיבוט ישיר או צעד אחד) או להפיק מתאי גזע עובריים (המכונה גם שיבוט עקיפה או שני שלבים). מאז היא הרבה יותר יעיל, כדי לייצר תאים ES, אנו בוחרים את הליך בן שני שלבים. במקרה מדען מעוניין שיבוט ישיר, blastocysts ניתן להעביר ישירות לתוך פסאודו נשים בהריון, כמתואר בסעיף 5.
ישנם פרוטוקולים רבים המתארים את הגזירה של תאים עובריים. זאת המתוארת כאן היא טכניקה רגילה, אשר מנצל תאים מזין, וגם בסרום עגל העובר.
- היום השני לאחר העברת הגרעין, להכין צלחת 96-U-היטב הגזירה תא ES.
- הוספת 100 μL לטין לתוך הבאר כל צלחת 96-U-היטב, דגירה למינימום של 10 דקות, ולהסיר אותו לאחר מכן.
- מזין הפשירי תאים resuspend בנפח של פי בינוני ESD, תאים מזין למשל שווה בשטח של 25 ס"מ הם 2 resuspended במדיום 10 מ"ל ESD ו 200 μL של ההשעיה תא נוסף בכל אחד ג'לטין שטופלו היטב.
- מכניסים את הצלחת לתוך באינקובטור ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 3.5 ימים, עוברים צריכה להיות בשלב הבלסטוציסט.
- הכינו צלחת חיידקי סטרילי על ידי ציפוי התא כמה טיפות ES בינוני thyrode חומצי.
- Blastocysts מועברים הראשון לתוך טיפות המכילות בינוני נורמלי תא ES מן הטיפות KSOM-AA ורחץ פעמיים.
- בזהירות להעביר קבוצה של blastocysts (blastocysts 50-10) לתוך טיפה אחת thyrode חומציים לשמור שם עד pellucida zona נמס.
- Blastocysts מועברים לאחר מכן לתוך ירידה בינונית עם ES, שטפתי פעמיים, ולאחר מכן להציב לתוך מצופה-במזין 96-U-גם צלחת (אחד הבלסטוציסט לתוך אחד טוב).
- עוברים הם מתורבתים אז 37 ° C CO, 5% 2 ימים 5-7 באינקובטור מבלי להפריע להם. זה נותן את הזמן העובר עדttach לשכבה מזין, וליצור תוצאה.
- הכן 24 גם צלחות, ניזונים על ידי ציפוי במדיום ESD לתוך כל טוב, למשל resuspend המקבילה של מזין 50 ס"מ 2 בינוני 12 מ"ל ESD, ולהוסיף 500 μL של השעיה על התא היטב כל אחד.
- מוציאים בזהירות את המדיום ESD מהצלחת 96-U-היטב עם העוברים, לשטוף היטב פעמיים עם כל 250 Hepes μL (או PBS), להוסיף 50 טריפסין μL ו דגירה דקות על 5 ב 37 ° C.
- פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים, עד תולדה התפרקה תוך השעיית תא בודד, להעביר לתוך צלחת 24 באר ו לדגור על 37 ° C CO, 5% 2.
- אם גזירה ESC היה מוצלח, מושבות ESC צריך להיות גלוי לאחר 7-10 ימים.
4.Blastocyst הזרקה
הזרקה של blastocysts היא טכניקה שגרתית ליצור כל סוג של מודל עכבר מהונדס. חשוב להזכיר כי הזרקה של blastocysts והעברת הבאים אל פסאודו נשים בהריון צריך להיות מתוזמן היטב.
- נקבות עכברים ראש עם PMS ו HCG כמתואר בסעיף 2.1. לאחר הזרקת HCG לשים נקבות עכברים יחד עם עכברים זכרים (נקבה אחת ואחד עכבר זכר לכל כלוב).
- למחרת, לבדוק הנקבות עבור תקעים. זו נחשבת 0.5dpc (ימים שלאחר משגל).
- עוברים מופרות מבודדים אז מן oviduct כמתואר בסעיף 2.1, תרבותי KSOM-AA למשך 3 ימים נוספים.
- הכן תאים ES ביום הזרקת הבלסטוציסט (3.5dpc).
- הסר בינוני מתאי גזע עובריים, לשטוף פעמיים עם Hepes (או PBS), להוסיף טריפסין ו דגירה של 5 דק 'ב 37 ° C.
- Resuspend תאים trypsinized עם המדיום ES, צלחת בצלחת, ואת דגירה של 45-60 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי להפחית את כמות התאים מזין (תאים מזין לדבוק מהר יותר מאשר תאים ES).
- מעבירים את ההשעיה התא דרך מסננת התא (40 או 70 מיקרומטר) לתוך צינור, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1000rpm.
- הסר supernatant, תא גלולה resuspend בינוני 500 ES בחנות μL על הקרח עד הצורך.
- הכן את המכסה של חיידקים בצלחת סטרילית על ידי טיפות המכילות ציפוי PVP ו HCZB.
- הכן מחט 15 מיקרומטר ידי טעינת עם כספית, הצבתו בתפקיד ושטיפת זה עם PVP.
- מקום קבוצה של blastocysts (10-30 blastocysts) לתוך ירידה עם HCZB, ולהוסיף 5-50 ES μL תא ההשעיה (תלוי בריכוז) אל תוך ירידה נוספת של HCZB.
- איסוף תאים ES (5-10 תאים) עם מחט הזריקה.
- מעבר לירידה עם blastocysts. יישר את blastocysts אופקית, ולתקן אחד עם המחט מחזיק באמצעות החלת ואקום.
- באמצעות מחט הזריקה להפוך את הבלסטוציסט עד מסת התאים הפנימית (ICM) הוא במיקום 9 בערב.
- המקום מחט הזריקה שלך ב 03:00, יש לוודא כי אין תאים ES בקצה המחט, ולהחיל piezo הדופק עד מחט הזריקה חודר דרך pellucida zona ואת trophectoderm לתוך blastocoel.
- שחרור תאים ES כמה (5-15 תאים), כך שתאי גזע עובריים להיצמד ICM. המשך עד blastocysts כל קבוצה כבר הוזרקו תאים עובריים.
- אחרי קבוצה אחת של blastocysts נגמר, לשטוף אותם פעמיים KSOM-AA ולשמור אותם טיפה עם KSOM-AA עד שכל blastocysts מוזרקים.
5. העברת העובר
העברת עוברים לתוך פסאודו נשים בהריון מהווה הליך כירורגי, אשר צריך להתבצע בזהירות רבה, על פי הנחיות המוסד החוקר.
- לטשטש את העכברים הנמען נקבה, להתגלח ברבע הימני התחתון, ולחטא.
- מספריים שימוש לפתוח את העור, להפריד את הצפק מן העור.
- אתר את השחלה דרך הצפק (נקודה אדומה), ולפתוח את הצפק בסמיכות השחלה.
- בעזרת מלקחיים, בזהירות לתפוס את oviduct ולשלוף את הרחם.
- להרים קבוצה של כ 10 blastocysts עם נימי מחוברת פיפטה בפה.
- תקן את הרחם עם מלקחיים, אגרוף שלם קטן לתוכו עם מחט קטנה, להוסיף את נימי עם blastocysts לתוך לומן של הרחם.
- בזהירות לשחרר את העוברים לתוך הרחם, להסיר נימי שלך.
- דחוף את הרחם חזרה לתוך חלל הבטן.
- אתר את הקצוות של הצפק ולסגור את זה עם כמה תפרים.
- סגור את העור של העכבר עם כמה סיכות.
- עבור הכאב שלאחר הניתוח, לנהל Carprofen 5 מיקרוגרם לכל מיליגרם של משקל הגוף.
באיור 1. סומטיים התא הגרעיניהעברת מוגדרים מראש בתאי T ברקע B6CF1. במספרים מוחלטים והן ביחס של העוברים שנוצר בתאי CD8 + T ותאי גזע עובריים שמקורם blastocysts SCNT.
איור 2. ניתוח תזרים נציג cytometric של עכברים chimeric הזריקו SCNT בתאי גזע עובריים. שער מספר (אחוזים מסך CD8 + ותאי T), מעיד על קיומו של תאים ספציפיים CD8 + T בעכברים chimeric.
Discussion
הראינו כאן כי SCNT יכול לשמש כדי ליצור עכברים transnuclear מתאי T עם סגוליות מוגדרים מראש. אמנם לא מוצג כאן, הטכניקה צריכה להיות שמיש גם לייצר עכברים transnuclear מתאי B עם סגוליות מוגדרים מראש.
דבר אחד חשוב שצריך לקחת בחשבון הוא זן ומין של העכבר, אשר נגוע או שחוסנו בשימוש לבודד T או תאים B של עניין. מאחר ותאי T ו-B יש יעילות reprogramming נמוך מאוד באופן כללי, אנו ממליצים להשתמש כלאיים F1 של haplotype הרצוי. מכיוון תא התורם גם קובע את המין, מומלץ להשתמש בתאי T או B מעכברים זכרים. משמעות הדבר היא כי רק עכברים chimeric זכר היה לשדר את TCR או BCR דרך germline, עם עכברים זכרים להיות קל ומהיר להתרבות.
יחדיו, אנו סבורים כי באמצעות תכנות מחדש epigenetic SCNT מהווה כלי רב עוצמה כדי ליצור סוג חדש של מודלים העכבר, אשר יהיה יתרון גדול בתחום החיסוני.
Disclosures
הפטנט הוגשה.
Acknowledgments
המחברים מודים לה 'אייזן, מ Gubbels, ק' ואן Grinsven, א Guillen, א דרייק, V. Mahajan, ש גאו, וג' יאפ לדיונים ריאגנטים פורה. אנחנו אסירי תודה על Dausman ג', ר 'פלאנרי, וג' ג'קסון לסיוע בניהול של המושבה העכבר. אנחנו אסירי תודה על פ וישנייבסקי עבור FACSorting. EMF נתמך על ידי תוכנית גבולות האדם למדע. RJ נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים RO1 HD045022 ו-R37-CA084198. HLP נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
- Schatz, D. G. V(D)J recombination. Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).
