Summary
私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールとして使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。
Abstract
T細胞のようなリンパ球は、、特定の特異性1の受容体を生成するために、遺伝V（D）J組換えを受ける。並び替え抗原特異的T細胞受容体（TCR）のためのトランスジェニックマウスは、T細胞の発達と機能を研究するために必要不可欠なツールでした。しかし、このようなTCRは、通常、多くの場合、不可避的に高い親和性とT細胞の選択を繰り返す抗原刺激、以下の長期培養後に、関連するT細胞から分離されています。 TCRのランダムゲノム統合α-およびβ-鎖と非内因性プロモーターからの発現は、発現レベルと動態の変動につながることができる。
体細胞核移植を介したエピジェネティックなリプログラミングは、関心のある任意のセルから胚性幹細胞とマウスを生成するツールを提供しています。エピジェネティックなマークがリセットされる間、その結果、SCNTは既知の特異性のT細胞に適用されるときに、これらの遺伝子のV（D）J再編成は、SCNT -胚性幹細胞（ES細胞）とそこから派生したマウスに転送されます。私たちは、 トキソプラズマ原虫に対する事前定義された特異性をもつT細胞が実験的に導入遺伝子を改変することなく、その内因性遺伝子座から特定 のTCRを発現マウスモデルを生成するために使用できることを実証した。そのようなtransnuclearモデルを得ることができるとの相対的な容易さと速度は、他の疾患モデルの構築のための可能性を秘めています。
Protocol
このメソッドは、で報告された研究で使用されてKirak ら 、Science 328（5975）、243〜248（2010） 。
1。ドナー細胞の分離
特定のTまたはB細胞がtransnuclearマウスモデルを生成するためのドナー細胞として使用できる前に、マウスは、興味のある病原体に感染したり、目的の抗原で免疫する必要があります。我々は、 トキソプラズマ原虫に対して特異的CD8 +細胞を使っているので、次のプロトコルは、これらの細胞や個人的な興味に応じて適応させる必要性の生成と分離を説明します。
- マウス脳のホモジネート（約40）に由来する嚢胞はBL / 6 H - 2 bとH - 2 dの制限されたCD8 + T細胞の両方の分離を可能にするXをBalb / c F1（B6CF1）マウスに腹腔内注射する。
- 免疫応答のピーク時には、感染したマウスは安楽死させた場合、脾臓を単離し、6 mLの赤血球（RBC）の溶解バッファーが含まれている皿に置かれた。
- 2つのカバーのスライドのつや消しの側面を使用して、脾臓は慎重に粉砕し、室温で5分間RBC溶解バッファー中でインキュベートされる。
- 14mlのPBSを追加、50mlファルコンチューブと300グラムで5分間、遠心分離機にセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。
- 上清を除去する、1.5mlのエッペンドルフチューブに1 mLのPBSと転送で細胞ペレットを再懸濁します。 300グラムで5分間遠心操作して、その後上清を取り除く。
- 、50μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁します関心の細胞型（例えばCD3、B220、CD8、およびCD4）を識別するための蛍光標識抗体を追加し、そして蛍光MHC - I四量体（CD4 T細胞のMHC - IIテトラマー）ロードされたラベルが付い4℃で30分間細胞懸濁液とインキュベートへの関心のペプチド℃の
- 1 mLのPBS、3 mlのPBSで300グラム、ペレットを再懸濁しますで5分間遠心分離を追加し、チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。
- （図1B）厳重にゲートを設定することにより、FACSortingを実行します。
2。体細胞核移植
体細胞核移植のためのいくつかのプロトコルがあります。ここで説明したものは、中期- IIおよびサイトカラシンBのためのドナー細胞を使用して第二減数分裂の阻害で逮捕された卵母細胞の使用はG0/G1期にあるかを必要とされることができます。
- 卵母細胞の調製
- BDF1背景の雌マウスは、午後5時と午後7時との間のマウスあたり5IU PMSで腹腔内注射する。
- 約47時間後、各マウスは5IU HCGを腹腔内に注入されます。
- HCG注射と同じ日に卵母細胞用培養皿を（KSOM - AAは、油の下に下がる）の準備及び° C、5％CO 2インキュベータ37内に配置します。また、水銀を使用してそれらをロードすることにより、体細胞核移植（核出術のための7μmと4またはリンパ球核の核移植のための5μm以下）のために必要な針を準備。
- マウスを安楽死させるとHCG後の13H（約8時）約卵管を分離。 HCZBの1〜2滴で卵を集める。
- 一つずつは、M2のw /ヒアルロニダーゼを含むドロップに卵管を移動する。ニックはforcepと慎重に卵管やドロップに卵母細胞 - 卵丘複合体を動かす。すべての卵母細胞 - 卵丘複合体が単離されている後、皿を37℃でインキュベートされた℃に
- 2〜5分間は（正確な時間はヒアルロニダーゼのバッチに依存する）卵母細胞を収集した後、HCZBとプレートそれらKSOM - AAの低下にに洗ってください。
- 卵母細胞の摘出
- SCNTプレートを作製するためにペトリ皿の蓋を使用してください。顕微鏡、およびマイクロマニピュレータを設定します。
- 眼球摘出を開始する前にPVPの除核の針（7ミクロン）を洗浄する。
- 摘出の場合は、サイトカラシンB（5μg/ mL）を持つHZCBのドロップに卵母細胞（10-30）のグループを置く。水平に（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。
- one卵母細胞を取り、保持している針の前面に配置します。真空を適用することによって、保持している針に卵母細胞を修正。脱核の針を使用して、染色体スピンドル複合体（CSC、しばしば"核"と呼ばれる）3時の位置になるまで卵母細胞を回します。
- ピエゾパルスを使用すると、卵母細胞にダメージを与えることなく、慎重に透明帯を貫通する。中期- IIのスピンドルに隣接する針の開口部を配置し、真空を適用する。 "核には"ゆっくりと針に移動する必要があります、そしてそれが完全に除去された後、膜は、それ自体を封印してください。
- KSOM - AA低下に戻って除核卵母細胞を移し、それらを複数回洗浄する。 eを繰り返します。卵母細胞の新しいグループと核形成ステップ。すべての卵を摘出または11AMについてまでされるまで続けます。
- 核転送
- 核移植のための、交流の核移植針（4〜5ミクロン）とPVPでそれを洗うと除核の針（7ミクロン）。
- PVPとドロップに興味のある細胞（例えばCD8 + T細胞）に配置、よく混ぜ、10分の最小インキュベート。
- サイトカラシンB（2.5μg/ mL）を持つHCZBのドロップに除核卵母細胞の群（10-30）を置きます。核移植の針を使用して水平方向（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。
- PVP -細胞懸濁液から、ドナー細胞をピックアップし、出たり入ったりの外膜は、（細胞膜と細胞質ゾルの断片が見えるはずです）に分解されるまで、それを吸引除去する。必要に応じてピエゾパルスを印加することができます。核が分離された後、針でそれを少し上に移動し、10から30になるまで核をピックアップし続けます。
- 整列除核卵母細胞を含むドロップして移動します。真空を適用することにより、保持針一つ卵母細胞を修正。透明帯への核移植の針が（核が離れて開幕からでなければならない）隣接配置し、針が透明帯を通過するまで、ピエゾパルスを適用する。慎重に、針の先端に1つの核を移動し、針の先端の2 / 3の内側になるまで卵母細胞に針を押し込みます。卵母細胞膜の少しが針になるように、小さな負圧を適用します。
- それは卵母細胞が実際に"オープン"である唯一の時間ですので次のステップは、非常に重要です。 、ピエゾの単一パルスを適用する正圧を印加することにより、針の核を押し出す、慎重に先端が卵母細胞の約1 / 3となるように針を引き戻すし、適用する負圧をとするために針を引き戻すために、引き続き卵母細胞を密封。各卵母細胞で、この手順を繰り返します。
- グループのすべての卵母細胞の核を受け取った後、彼らはKSOM - AAの媒体中で洗浄し、培養する。すべての卵母細胞でこの手順を繰り返します。
- 最後のグループは30分の最低KSOM - AAの文化をされた後、SCNT -胚はSrCl2を含むCA -フリー化メディアの低下に転送されます。
- 活性化の6時間後、疑似前核（PPN）陽性SCNT -胚の量が決定されます。彼らは胚盤胞期に到達するまでの胚はその後さらに3.5日間KSOM - AA降下で洗浄し、培養する。
- 選択の薬物や化学物質（例えばトリコスタチンAなど）の活性化と培養培地に加えることができる。
胚性幹細胞の3.Derivation
SCNT -胚盤胞を偽妊娠の雌（また、直接またはワンステップクローニングとも呼ばれる）に転送するといずれか、または胚性幹細胞を（また間接的または二段階クローニングとも呼ばれる）を導出するために使用することができます。それはES細胞を生成するためにはるかに効率的なので、我々は2段階の手順を選択してください。科学者が直接クローニングすることに興味を持っている場合にはセクション5で説明したように、胚盤胞を偽妊娠の雌に直接転送することができます。
胚性幹細胞の派生を説明する多くのプロトコルがあります。ここで説明したものは、フィーダー細胞、及びウシ胎児血清を利用した標準的な技法、である。
- 核移植後の二日目、ES細胞の導出のための96 - U -ウェルプレートを準備。
- 10分の最小インキュベート96 U - wellプレートの各ウェルにゼラチン100μLを、追加、そしてその後それを削除してください。
- 融解フィーダー細胞とESD培地の応じてボリュームに再懸濁し、25cm 2の面積に相当するなどのフィーダー細胞を10mLのESD培地および細胞懸濁液200μLで再懸濁しているがよくゼラチン処理したのそれぞれに追加されます。
- 37℃インキュベーターと文化にプレートを入れ° C、5％CO 2。
- 3.5日後、胚は胚盤胞の段階になっているはず。
- 数滴のES細胞用培地と酸性thyrodeをめっきすること滅菌細菌の料理を準備します。
- 胚盤胞は、最初に通常のES細胞の培地を含む水滴にKSOM - AAドロップから転送され、2回洗浄する。
- 慎重に酸性thyrodeの一滴に胚盤胞のグループを（5-10胚盤胞）に転送し、透明帯が溶解するまでそこに置いてください。
- 胚盤胞は、その後、ES培地のドロップに移して2回洗浄し、その後、フィーダーでコーティングされた96 - U - wellプレート（上手にへの1つ胚盤胞）に置かれます。
- 胚は、それらを乱すことなく37℃、5％CO 2でインキュベーターで5-7日間培養する。これにより、胚の時間を与えるフィーダー層にttach、および伸長を形成する。
- 各ウェルにESD培地にプレーティングフィーダによって、24ウェルプレートを準備し、例えば12 mLのESD培地では50 cm 2とフィーダと同等のものを再懸濁し、そして各ウェルに細胞懸濁液の500μLを加える。
- 慎重に胚96 - U -ウェルプレートからESD培地を除去、250μLHEPES（またはPBS）で2回各ウェル洗浄、50μLのトリプシンを追加し、37℃で約5分間インキュベート℃に
- 副産物は、単一細胞懸濁液、37℃で24ウェルプレートとインキュベートに転送° C、5％CO 2。に離れて落ちてまで、複数回上下にピペッティング
- ESCの導出が成功した場合は、ESCのコロニーは、7〜10日後に見えるはずです。
4.Blastocyst注入
胚盤胞の注入は、トランスジェニックマウスモデルの任意の種類を生成するルーチンのテクニックです。胚盤胞の注入と偽妊娠の雌に、後続の転送がうまくタイミングが必要であることを言及することが重要です。
- PMSとHCGと首相雌マウスは、セクション2.1で説明した。 HCG注射後の雄マウス（ケージごとに一人の女性、男性1マウス）と一緒に雌マウスを置く。
- 翌日、プラグ用の雌を確認してください。これは、0.5dpc（日後に性交）としてカウントされます。
- 受精胚は、その後のセクション2.1で説明したように卵管から分離し、さらに3日間KSOM - AAで培養されています。
- 胚盤胞注入（3.5dpc）の日にES細胞を準備します。
- ES細胞から培地を除去、37、HEPES（またはPBS）で2回洗浄トリプシンを追加し、5分間インキュベート℃に
- ES培地、皿にプレートし、37℃で45〜60分間インキュベート（フィーダー細胞は、より高速なES細胞より付着）フィーダー細胞の量を減らすために、C、5％CO 2で再懸濁し、トリプシン処理細胞。
- チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液を移し、そして1000rpmで5分間遠心操作。
- 必要になるまで氷上で500μLES培地とストアに上清を、再懸細胞ペレットを削除します。
- PVPとHCZBを含むめっき低下によって滅菌細菌ディッシュの蓋を準備します。
- 、水銀と載荷位置に置くとPVPとのそれを洗浄することにより15μmの針を準備します。
- HCZBとドロップに胚盤胞（10〜30個の胚盤胞）のグループを置き、そしてHCZBの別のドロップに50から50μLのES細胞懸濁液（濃度に依存する）に追加します。
- 注射針でES細胞を（50セル）ピックアップします。
- 胚盤胞でドロップに移動します。水平に胚盤胞を合わせ、真空を適用することにより保持している針を持つものを修正。
- 内細胞塊（ICM）9時の位置になるまで注射針を使用すると、胚盤胞を回します。
- 、3時位置にして注射針を置き、針の先端にはES細胞がないことを確認して、注射針が胞胚腔に透明帯と栄養外胚葉を貫通するまでピエゾパルスを適用する。
- ES細胞はICMに固執するように、少数のES細胞を（5-15セル）を離します。グループのすべての胚盤胞は、ES細胞を注入されるまで続けます。
- 胚盤胞の一つのグループが終了した後、KSOM - AAで二度、それらを洗浄し、胚盤胞が注入されるまで、それらKSOM - AAとドロップにしてください。
5。胚移植
偽妊娠の雌への胚の転送は非常に慎重にと研究者の機関のガイドラインに従って実施する必要がある手術を、表します。
- 、女性レシピエントマウスをAnaesthetize右下の象限を剃って、消毒。
- 使用してはさみで皮膚を開き、そして皮膚から腹膜を分離。
- 腹膜（赤色スポット）を介して卵巣を見つけ、そして卵巣に近接して腹膜を開きます。
- 鉗子を使用して、慎重に卵管を取得し、子宮を引き出します。
- 口のピペットに接続されているキャピラリーで約10胚盤胞のグループをピックアップ。
- 一鉗子で子宮を固定し、小さな針で、そこに小さな全体をパンチし、子宮の内腔に胚盤胞と毛細血管を挿入します。
- 慎重に子宮に胚を解放し、キャピラリを取り外します。
- 腹腔内に戻って子宮を押してください。
- 腹膜のエッジを見つけ、少数のステッチで閉じます。
- いくつかのステープルでマウスの皮膚を閉じます。
- 手術後の痛みの場合は、体重mg当たり5μgのカルプロフェンを管理する。
図1体細胞核B6CF1バックグラウンドで事前に定義されたT細胞の伝達。 SCNT胚盤胞から派生したCD8 + T細胞と胚性幹細胞から生成された胚の絶対及び相対番号。
図2。SCNT胚性幹細胞を注入キメラマウスの代表的なフローサイトメトリー分析。ゲートと数字は（合計CD8 + T細胞あたりのパーセント）キメラマウスにおける特異的CD8 + T細胞の存在を示している。
Discussion
我々は、SCNTが事前定義された特異性T細胞からtransnuclearマウスを生成するために使用できることをここに示している。ここには示されていませんが、テクニックは、事前定義された特異性を有するB細胞からtransnuclearマウスを生成するために利用できるようになるはずです。
考慮すべき重要な点は、感染や免疫や興味のTまたはB細胞を分離するために使用されるマウスの系統、性別、です。 TとB細胞は一般に非常に低い初期化の効率を持っているので、我々は、目的のハプロタイプのF1雑種を使用することをお勧めします。ドナー細胞はまた、性別を決定するので、我々は、雄マウスからT細胞またはB細胞を使用することをお勧めします。これは、唯一の雄キメラマウスが繁殖しやすく、高速であるという雄マウスで、生殖細胞系列を介してTCRやBCRを送信になってしまいます。
一緒になって、我々は、SCNTを介してそのエピジェネティックなリプログラミングが免疫学的フィールドの大きな利点となるのマウスモデルの新しいタイプを生成するための強力なツールを、表すと思う。
Disclosures
特許が出願されています。
Acknowledgments
著者らはH.アイゼン、M. Gubbels、K.バンGrinsven、E. Guillenは、A.ドレイク、V.マハジャン、Q.高、そして有意義な議論と試薬のG.ヤップに感謝しています。私たちはJ. Dausman、R.フラナリー、およびマウスのコロニーの管理と支援のためのJ.ジャクソンに感謝しています。我々はFACSorting用P. Wisniewskiはに感謝しています。 EMFは、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムによってサポートされていました。 RJは、健康補助金RO1 - HD045022とR37 - CA084198の国立研究所によってサポートされていました。 HLPは、国立衛生研究所からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
- Schatz, D. G. V(D)J recombination. Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
- Eggan, K. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).
- Kishigami, S. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).
- Wakayama, T., Yanagimachi, R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).
