Summary
우리는 체세포 핵 전송 (SCNT)를 통해 epigenetic 프로그래밍이 사전 정의된 T 세포 수용체 (TCR) specificities와 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 여기를 보여줍니다. 이러한 transnuclear 생쥐는 내생 모터의 제어하에 자신의 내생 로커스에서 해당 TCR을 표현.
Abstract
같은 T 세포와 같은 Lymphocytes은 어떤 특이성 1 수용체를 생성, 유전자 V (D) J 재조합을 받고있다. 에 대한 유전자 변형 쥐 뜯어 항원에 특정한 T 세포 수용체 (TCR)가 T 세포 개발 및 기능을 연구하기 위해 필수적인 도구가되었습니다. 그러나, TCRs는 대개 피할 높은 친화력과 T 세포에 대한 선택 반복 항원 자극, 다음과 같은 장기적인 문화 이후 관련 T 세포에서 격리됩니다. TCR의 임의 게놈 통합 α -와 β - 체인 및 비 내생 발기인의 표현이 표현 수준과 속도론의 차이가 발생할 수 있습니다.
체세포 핵 송금을 통해 Epigenetic 프로그래밍 관심의 세포에서 배아 줄기 세포와 마우스를 생성하는 도구를 제공합니다. epigenetic 자국이 재설정하는 동안 따라서, SCNT가 알려진 특이성의 T 세포에 적용되었을 때, 이러한 유전자 V (D) J의 rearrangements는 SCNT - 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 그들에서 파생 마우스로 전송됩니다. Toxoplasma gondii 우리에 대해 미리 정의된 specificities와 T 세포가 실험적으로 도입 유전자 수정하지 않고, 그들의 내생 loci에서 특정 TCR을 표현 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수있는 것을 증명하고있다. 이러한 transnuclear 모델 얻을 수있는 상대 간편하고 속도가 다른 질병 모델의 건설에 대한 약속을 보유하고 있습니다.
Protocol
이 방법에 보고된 연구에 사용된 Kirak 외., 과학 328 (5975), 243-248 (2010)가 .
1. 기증자 세포 분리
특정 T 또는 B 세포가 transnuclear 마우스 모델을 생성하기 위해 기증자 세포로 사용할 수 있습니다 전에 쥐를 관심의 병원체와 감염이나 관심의 항원과 예방 접종을해야합니다. Toxoplasma gondii 우리가 특정 CD8 + 세포를 사용했기 때문에 다음과 같은 프로토콜은 개인적인 관심에 따라 적응 이러한 세포와 요구의 생성 및 절연을 설명합니다.
- 마우스 뇌 homogenate (40)에서 파생된 Cysts는 BL / 6 H - 2 B와 H - 2 D 제한 CD8 + T 세포 모두의 고립을 가능하게 X Balb / C F1 (B6CF1) 마우스로 내부 peritoneally를 주입하고 있습니다.
- 면역 반응의 정상에 감염된 마우스 euthanized이며, 비장 고립 6 ML 적혈구 세포 (RBC) 용해 버퍼를 포함하고있는 그릇에 배치.
- 두건의 살인 사건이 은폐 슬라이드의 서리 낀 측면을 사용하여 비장이 신중하게 지상과 RT에서 5 분 RBC의 용해 버퍼에서 incubated입니다.
- 14 ML PBS를 추가, 50 ML 팔콘 튜브와 300g에서 5 분 원심 분리기에 셀 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
- 뜨는 제거, 세포 펠렛은 1.5 ML Eppendorf 튜브에 1 ML PBS 및 전송에 resuspend. 300g에서 5 분 원심 분리기와 나중에 뜨는를 제거합니다.
- , 50 μL PBS에 세포 펠렛을 Resuspend 관심의 세포 유형 (예 인 경우에는 3 번 CD, B220, CD8 및 CD4)를 식별 찬란 표시된 항체를 추가하고, 찬란 MHC - I tetramer (CD4 T 세포에 대한 MHC - II tetramer) 로드된 표시 4 30 분에 대한 세포 현탁액과 부화 관심 펩타이드 ° C.와 함께
- 1 ML PBS, 3 ML PBS에서 300g, resuspend 펠렛에서 5 분 원심 분리기를 추가하고, 튜브에 세포 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다.
- (그림 1B) stringently 성문을 설정하여 FACSorting을 수행합니다.
2. 체세포 핵 전송
체세포 핵 이전을위한 몇 가지 프로토콜이있다. 사람은 여기 Metaphase - II에서 체포 oocytes을 사용하게하고 Cytochalasin B. 따라서 기증자의 세포를 사용하여 두 번째 meiotic 부문의 억제가 G0/G1 단계에있는 필요합니다 설명했다.
- oocytes의 준비
- BDF1 배경의 여성 생쥐는 오후 5시과 오후 7시 사이에 마우스를 따라 5IU PMS와 내부 peritoneally를 주입하고 있습니다.
- 약 47시간 후, 각각의 마우스는 5IU HCG와 내부 peritoneally를 주입합니다.
- HCG 주사 같은 날에 oocytes의 문화 요리 (KSOM - AA가 기름 방울 이하)을 준비하고 인큐베이터 37에 그들을 배치 ° C 5 % CO 2. 또한 수은을 로딩하여 SCNT (핵의 제거를위한 7μm 4 또는 림프구 핵의 핵 이전에 대한 5μm)에 필요한 바늘을 준비합니다.
- 쥐를 안락사와 HCG 후 13h (약 오전 8시)에 대한 oviducts을 분리. HCZB 1-2 방울의 oviducts를 수집합니다.
- 한 - 바이 - 하나 M2 W / Hyaluronidase을 포함하는 드롭으로 oviducts 이동합니다. 닉은 forcep과 함께 신중하게 수란관하고 드롭에 oocyte - 적운 - 복잡한 이동합니다. 모든 oocyte - 적운 - 단지가 고립되어 있고, 요리가 37 incubated 있습니다 ° C. 후
- 2-5 분 (정확한 시간은 Hyaluronidase의 배치에 따라 다름) oocytes를 수집 후, HCZB 및 플레이트 그들 KSOM - AA의 방울로에 씻으십시오.
- oocytes의 핵의 제거
- SCNT 접시를 준비하기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 사용합니다. 현미경 및 micromanipulator를 설정합니다.
- 핵의 제거와 함께 시작하기 전에 PVP에서 핵의 제거 바늘 (7 μm의)를 씻으십시오.
- 핵의 제거를위한, Cytochalasin B (5 μg / ML)로 HZCB의 드롭으로 oocytes의 그룹 (10-30)를 놓으십시오. 수평 라인 - 업 oocytes (5 분 min.) 잠복기 동안.
- 한 oocyte을 가지고 개최 바늘 앞에서 그것을 놓으십시오. 진공을 적용하여 잡고 바늘에 oocyte을 수정. 핵의 제거의 바늘을 사용하여 염색체 스핀들 - 복합 (CSC, 종종 "핵")를 3시 위치에까지 oocyte를 켜십시오.
- 압전 - 펄스는 oocyte를 손상하지 않고 신중하게 조나 pellucida 침투 사용합니다. Metaphase - II 스핀들에 인접한 바늘의 개방 장소와 진공을 적용합니다. "핵"는 천천히 바늘로 이동해야하고, 완전히 제거되면 멤브레인 자체가 봉쇄해야합니다.
- KSOM - AA 방울로 다시 enucleated oocytes를 전송하고, 그들에게 여러 번 씻는다. 전자를 반복oocytes의 새로운 그룹과 핵 단계. 모든 계란이 enucleated 또는 오전 11시에 대한 때까지 때까지 계속합니다.
- 핵 전송
- 핵 전송, 교환 핵 전송 바늘 (4 ~ 5 μm의)와 PVP로 씻어와 핵의 제거 바늘 (7 μm의).
- , PVP와 드롭으로 관심의 세포를 (예 : CD8 + T 세포) 장소 잘 섞어 10 분 최소 품어.
- Cytochalasin B (2.5 μg / ML)로 HCZB의 드롭으로 enucleated oocytes의 그룹 (10-30)를 놓으십시오. 핵 전송 바늘을 사용하여 라인 업 oocytes 가로 (5 분 min.) 잠복기 동안.
- PVP - 세포 현탁액에서 기증자 세포를 들고 및 및 아웃 바깥 막가 (막과 cytosol의 조각이 표시되어야합니다) 분해 때까지 그것을 대기음. 필요한 경우 압전 - 펄스는 적용할 수 있습니다. 핵이 고립되면, 바늘에 약간에게 위로 이동하고 10-30을 때까지 핵을 데리러 진행합니다.
- 정렬 enucleated oocytes를 포함하는 드롭로 이동합니다. 진공을 적용하여 들고 바늘 한 oocyte을 수정. 핵 전송 바늘 (핵 될 멀리 열한다) 조나 pellucida에 인접하고 바늘이 조나 pellucida를 통과하기 전까지는 압전 - 펄스를 적용 플레이스. 신중하게, 바늘의 끝에 하나의 핵으로 이동 바늘 끝이 삼분의이 안에 때까지 oocyte에 바늘을 밀어. oocyte 막의 약간은 바늘에 있도록 작은 부정적인 압력을 적용합니다.
- oocyte 실제로 "열기"때 그것은 유일한 시간이기 때문에 다음 단계는 매우 중요합니다. , 압전의 단일 펄스를 적용 긍정적인 압력을 적용하여 바늘의 핵심을 밀어 조심스럽게 팁이 oocyte의 1 / 3에 대한되도록 바늘을 다시 끌어와 다음 적용을 부정적인 압력을하고 바늘을 다시 끌어 계속 oocyte을 봉쇄. 각 oocyte이 단계를 반복합니다.
- 그룹의 모든 oocytes이 핵을받은 후, 그들은 KSOM - AA 미디어의 세탁 및 양식입니다. 모든 oocytes이 절차를 반복합니다.
- 마지막 그룹은 30 분 최소 KSOM - AA의 문화를했습니다 후 SCNT - 배아는 SrCl2를 포함하는 CA - 무료 정품 미디어의 방울로 전송됩니다.
- 활성화 6 시간 후, 의사 pronuclei의 양을 (PPN) - 긍정적인 SCNT - 배아가 결정됩니다. 그들은 blastocyst 단계에 도달하기 전까지 배아는 다음 세탁 및 KSOM - AA에서 양식하는 것은 추가 3.5 일 방울.
- 약물 또는 화학 물질을 선택 (예 : Trichostatin 등)이 활성화 및 문화 미디어에 추가할 수 있습니다.
배아 줄기 세포의 3.Derivation
SCNT - blastocysts은 의사 임신 여성 (또한 직접 또는 한 단계 복제라고도 함)로 그들을 전송하거나, 배아 줄기 세포를 (또한 간접 또는 두 단계의 복제라고도 함) 파생하는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 훨씬 더 ES 세포를 생성하는 효율적인 것이므로, 우리는 두 단계 절차를 선택합니다. 과학자가 직접 복제에 관심이 경우에는 제 5에 설명한 바와 같이, blastocysts은 의사 임신 여성에 직접 전송할 수 있습니다.
배아 줄기 세포의 유도를 설명하는 많은 프로토콜이 있습니다. 여기에서 설명한 사람은 피더 세포 및 태아 송아지 혈청을 이용하여 표준 기술입니다.
- 핵이 완료된 후 두 번째 날, ES 세포 유도를위한 96 U - 잘 접시를 준비합니다.
- 10 분 최소 품어 96 U - 잘 플레이트의 각 우물에 다행 100 μL를 추가하고 나중에 그것을 제거합니다.
- 해동 피더 세포와 ESD 매체에 따라 볼륨에 resuspend, 25cm 2 면적에 상응하는 등 피더 세포가 10 ML ESD 매체와 세포 현탁액 200 μL에 resuspended 아르는 젤라틴 - 처리 자의 각에 추가됩니다.
- 37 보육과 문화에 접시를 넣어 ° C 5 % CO 2.
- 3.5 일 후에 배아는 blastocyst 단계에서해야합니다.
- 몇 방울의 ES 세포 매체와 산성 thyrode을 도금하여 살균 박테리아 요리를 준비합니다.
- blastocysts 먼저 일반 ES 세포 매체를 포함 방울로 KSOM - AA 방울에서 전학을 두 번 세탁하고 있습니다.
- 조심스럽게 산성 thyrode 한방울로 blastocysts 그룹을 (5-10 blastocysts) 전송 및 조나 pellucida가 해산 때까지 거기에 계속.
- blastocysts은 다음 ES 매체와 드롭으로 전송 번 씻어 다음 피더 - 코팅 96 U - 잘 플레이트 (물론 하나에 하나 blastocyst)에 배치됩니다.
- 배아는 그들을 방해하지 않고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 5~7일에 대한 양식입니다. 이것으로 배아 시간을 제공합니다피더 레이어 ttach, 그리고 가지를 형성합니다.
- 각 우물에 ESD 매체 도금 모이통에 의해, 24 잘 접시를 준비, 예를 들어 12 ML ESD 매체 50cm이 피더의 동등한 resuspend, 각 우물에 세포 현탁액 500 μL를 추가합니다.
- 조심스럽게 배아와 96 U - 잘 판에서 ESD 매체를 제거, 250 μL Hepes (또는 PBS)으로 두 번 각 잘 씻고, 50 μL 트립신을 추가하고 37 약 5 분 품어 ° C.
- 가지는 단일 세포 현탁액, 37에서 24 잘 판과 부화로 전송 ° C, 5 % CO 2.로 나빠진 때까지 여러 번 위아래로 피펫
- ESC의 유래가 성공했다면 ESC의 식민지가 7~10일 후 표시됩니다.
4.Blastocyst 주입
blastocysts의 주입은 유전자 변형 마우스 모델의 어떤 종류를 생성하는 루틴을 기술입니다. blastocysts 및 의사 임신 여성에 후속 송금의 주입이 잘 초과 수 있어야함을 언급하는 것이 중요합니다.
- PMS와 HCG와 국무 여성 마우스는 섹션 2.1에서 설명한. HCG 주사는 남성 생쥐 (한 여자와 케이지 당 한 남성 마우스)와 함께 여성 쥐를 넣어 후에.
- 그 다음날, 플러그에 대한 여자를 확인하십시오. 이 0.5dpc (일 게시물 성교)로 계산됩니다.
- 수정된 배아는 다음 추가 3 일간 KSOM - AA 섹션 2.1에서 설명한하고, 교양 등 수란관에서 격리됩니다.
- blastocyst 사출 (3.5dpc)의 당일 ES 세포를 준비합니다.
- ES 세포에서 매체를 제거, 37, Hepes (또는 PBS)으로 두 번 씻어 트립신을 추가하고 5 분 품어 ° C.
- ES 매체, 접시에 접시, 37에서 45-60 분 품어 ° C 5 % 피더 세포 (피더 세포가 빠르게 ES 세포보다 준수)의 양을 줄이기 위해 CO 2.와 Resuspend trypsinized 세포
- 튜브에 세포 스트레이너 (40 ~ 70 μm의)를 통해 세포 현탁액을 전송하고, 1000rpm에서 5 분 원심 분리기.
- 필요까지 얼음에 500 μL ES 매체와 저장소에 뜨는, resuspend 세포 펠렛을 제거합니다.
- PVP와 HCZB를 포함하는 도금 방울에 의해 살균 세균 접시의 뚜껑을 준비합니다.
- , 수은과 장착 위치에 놓는과 PVP로 씻는하여 15 μm의 바늘을 준비합니다.
- HCZB와 드롭에 blastocysts (10-30 blastocysts)의 그룹을 장소, HCZB 다른 드롭으로 5-50 μL ES 세포 현탁액을 (농도에 따라 다름) 추가합니다.
- 사출 바늘로 ES 세포를 (50-100 셀) 픽업.
- blastocysts와 드롭로 이동합니다. 수평 blastocysts을 정렬하고, 진공을 적용하여 잡고 바늘로 하나를 수정.
- 내부 세포 덩어리 (ICM)가 9시 위치에까지 주사 바늘을 사용하면 blastocyst을 켜십시오.
- 3시 방향에서 분사 바늘을 플레이스, 바늘의 끝에 아무 ES 세포가 없다는 것을 확인하고, 주사 바늘이 조나 pellucida과 blastocoel에 trophectoderm를 통해 침투까지 압전 - 펄스를 적용합니다.
- ES 세포는 ICM에 집중하므로, 몇 ES 세포를 (5-15 셀) 출시. 그룹의 모든 blastocysts은 ES 세포로 주입 때까지 계속합니다.
- blastocysts 중 한 그룹이 완료되면 KSOM - AA에 두 번 그들을 씻어 모든 blastocysts가 주입되기 전까지는 그들 KSOM - AA와 드롭 유지.
5. 배아 전송
의사 - 임신 여성에 배아의 전달은 매우 신중하고 연구자의 기관의 지침에 따라 실시해야 수술을 나타냅니다.
- 여성받는 쥐를 마취시키다 오른쪽 아래 사분면을 면도하고, 소독.
- 사용 가위는 피부를 열고 피부에서 복막을 분리.
- 복막 (붉은 반점)를 통해 난소를 찾아서, 그리고 난소 가까이에있는 복막을 엽니다.
- 포셉 사용하여 신중하게 수란관을 움켜잡고 자궁을 빼낸다.
- 입 피펫에 연결된 모세관과 함께 약 10 blastocysts의 그룹을 선택하십시오.
- 한 집게로 자궁을 수정, 작은 바늘로 그것으로 작은 전체를 펀치, 그리고 자궁의 루멘에 blastocysts과 모세를 삽입합니다.
- 조심스럽게 자궁에 배아를 출시하고 모세관을 제거하십시오.
- 복강으로 다시 자궁으로 밀어.
- 복막의 가장자리를 찾아 몇 바늘로 닫습니다.
- 몇 스테이 플스와 마우스의 피부를 닫습니다.
- 포스트 수술 고통 들어, 체중의 MG 당 5 μg의 Carprofen을 관리할 수 있습니다.
그림 1. 체세포 핵 세포B6CF1 배경으로 미리 정의된 T 세포의 양도. SCNT blastocysts에서 파생된 CD8 + T 세포와 배아 줄기 세포에서 생성된 배아의 절대와 상대 번호.
그림 2. SCNT 배아 줄기 세포로 주입 키메라 쥐를 대표 흐름 cytometric 분석. 게이트 번호 (총 CD8 + T 세포 당 퍼센트) 키메라 생쥐의 특정 CD8 + T 세포의 존재를 나타냅니다.
Discussion
우리는 SCNT가 미리 정의된 특이성과 T 세포에서 transnuclear 마우스를 생성하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시합니다. 여기에 표시되지 않지만,이 기술은 또한 미리 정의된 특이성과 B 세포에서 transnuclear 마우스를 생성하기 위해 사용 가능해야합니다.
고려해야 할 중요한 한 가지는 감염이나 예방 접종 및 T 또는 관심있는 B 세포를 분리하는 데 사용되는 마우스의 변형과 성별입니다. T와 B 세포가 일반적으로 매우 낮은 프로그래밍 효율을 가지고 있기 때문에, 우리는 원하는 haplotype의 F1 하이브리드를 사용하는 것이 좋습니다. 기증자 세포는 또한 섹스를 결정하기 때문에, 우리는 T 또는 남성 생쥐의 B 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 오직 남자 키메라 마우스들이 번식을 쉽고 빠르게하고 남성 생쥐와 germline 통해 TCR이나 BCR 전송 거지.
함께 찍은, 우리는 SCNT를 통해 그 epigenetic 프로그래밍이 면역 분야에 대한 큰 이점이 될 것입니다 마우스 모델의 소설 유형을 생성하기위한 강력한 도구를 나타냅니다 생각합니다.
Disclosures
특허가 제출되었습니다.
Acknowledgments
저자 H. 아이젠, M. Gubbels, K. 반 Grinsven, E. 길렌, A. 드레 이크, V. Mahajan, Q. 가오, 유익한 토론과 시약에 대한 G. 야프에 감사하고 있습니다. 우리는 J. Dausman, R. 플레너리 및 마우스 식민지의 관리와 지원 J. 잭슨 감사합니다. 우리는 FACSorting위한 P. Wisniewski에 감사하고 있습니다. EMF는 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다. RJ는 건강 보조금 RO1 - HD045022 및 R37 - CA084198 국립 연구소에 의해 지원되었다. HLP는 건강의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
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