Summary
Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.
Abstract
Lymphozyten, wie T-Zellen, eine genetische V (D) J-Rekombination, die an einen Rezeptor mit einer bestimmten Spezifität 1 zu erzeugen. Mäuse transgene für eine neu Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) haben ein unverzichtbares Werkzeug, um T-Zell-Entwicklung und Funktion untersucht worden. Allerdings sind solche TCRs in der Regel aus dem jeweiligen T-Zellen nach einer Langzeit-Kultur oft nach wiederholter Antigen-Stimulation, die unvermeidlich wählt für T-Zellen mit hoher Affinität isoliert. Zufällige genomische Integration der TCR α-und β-Kette und Ausdruck von Nicht-endogenen Promotoren können auf Veränderungen in Expression und Kinetik führen.
Epigenetische Reprogrammierung über Kerntransfer somatischer Zellen bietet ein Werkzeug, um embryonale Stammzellen und Mäuse aus jeder Zelle von Interesse zu erzeugen. Folglich wird, wenn SCNT um T-Zellen des bekannten Spezifität angewendet wird, werden diese genetischen V (D) J Umlagerungen der SCNT-embryonalen Stammzellen (ESZ) und die Mäuse aus ihnen abgeleiteten übertragen, während epigenetische Markierungen zurückgesetzt werden. Wir haben gezeigt, dass T-Zellen mit vordefinierten Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii verwendet werden, um Maus-Modelle, die die spezifischen TCR Ausdruck von ihren endogenen Loci, ohne experimentell genetische Veränderung zu erzeugen. Die relative Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der solche transnuclear Modelle gewonnen werden können verspricht für den Bau anderer Krankheitsmodelle.
Protocol
Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolation von Spenderzellen
Bevor spezifischen T-oder B-Zellen als Spenderzellen verwendet werden kann, um transnuclear Mausmodellen zu erzeugen, brauchen Mäuse mit einem Pathogen infiziert von Interesse sein oder immunisiert mit einem Antigen von Interesse. Da wir CD8 +-Zellen spezifisch für Toxoplasma gondii verwendet haben, wird das folgende Protokoll beschreibt die Erzeugung und Isolierung dieser Zellen und muss je nach persönlichem Interesse angepasst werden.
- Zysten von einer Maus Hirnhomogenat (ca. 40) abgeleitet werden intraperitoneal in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) Mäusen, die Trennung der beiden H-2 b und H-2 d restringierte CD8 + T-Zellen ermöglicht injiziert.
- Auf dem Höhepunkt der Immunantwort, wird die infizierte Maus eingeschläfert, der Milz isoliert und in eine Schale mit 6 ml roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer.
- Mit dem mattierten Seiten von zwei Deckgläser, ist die Milz sorgfältig geschliffen und inkubiert in der RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT.
- Fügen Sie 14 ml PBS, filtern die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in einen 50 ml Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300g.
- Überstand entfernen, Zellpellet in 1 ml PBS und Überführung in eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 300g und Überstand danach.
- Zellpellet in 50 ul PBS, fügen fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf den jeweiligen Zelltyp von Interesse (zB CD3, B220, CD8 und CD4) zu identifizieren, und fluoreszenzmarkierten MHC-I-Tetramer (MHC-II-Tetramer für CD4 T-Zellen) geladen mit dem Peptid von Interesse für die Zell-Suspension und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
- 1 ml PBS, Zentrifuge für 5 min bei 300 g, Pellet in 3 ml PBS, und filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Rohr.
- Führen FACSorting, indem Sie die Tore stringent (Abbildung 1B).
2. Somatic Cell Nuclear Transfer
Es gibt ein paar Protokolle für Somatic Cell Nuclear Transfer. Die hier beschriebene nutzt Eizellen in der Metaphase-II festgenommen und die Hemmung der zweiten Reifeteilung mit Cytochalasin B. Deshalb Spenderzellen benötigt, die in G0/G1 Phase.
- Vorbereitung von Oozyten
- Weibliche Mäuse von BDF1 Hintergrund sind intraperitoneal mit 5IU PMS pro Maus von 17.00 bis 07.00 Uhr injiziert.
- Etwa 47 Stunden später wird jeder Maus intraperitoneal mit 5IU HCG injiziert.
- Bereiten Sie eine Kulturschale (KSOM-AA Tropfen unter Öl) für die Eizellen noch am selben Tag wie der hCG-Injektion und legen Sie sie in einen Inkubator 37 ° C, 5% CO 2. Auch bereiten sich die Nadeln, die für SCNT (7μm für Enukleation und 4 oder 5 um für Kerntransfer von Lymphozytenkerne), indem Sie sie mit Quecksilber.
- Euthanize Mäusen und isolieren Eileiter über 13h nach HCG (ca. 8 Uhr). Sammeln Sie die Eileiter in 1-2 Tropfen HCZB.
- One-by-one bewegen Sie den Eileiter in einen Tropfen mit M2 w / Hyaluronidase. Nick den Eileiter vorsichtig mit einem ForceP und bewegen Sie die Oozyten-Cumulus-Komplex in der Drop. Nachdem alle Oozyten-Cumulus-Komplexe isoliert worden sind, die Schale ist bei 37 ° C.
- Nach 2-5 min (die genaue Zeit hängt von der Partie Hyaluronidase) sammeln die Oozyten, in HCZB und Platte sie in KSOM-AA Tropfen waschen.
- Enukleation der Oozyten
- Verwenden Sie den Deckel einer Petrischale, die SCNT Platte vorbereiten. Richten Sie das Mikroskop und der Mikromanipulator.
- Waschen Sie die Enukleation Nadel (7 um) in PVP vor dem Start mit Enukleation.
- Für Enukleation, statt eine Gruppe von Oozyten (10-30) in einen Tropfen HZCB mit Cytochalasin B (5 ug / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up der Eizellen horizontal.
- Nehmen Sie eine Eizelle und stellen Sie ihn vor der Holding Nadel. Fix die Eizelle nicht die Haltung Nadel durch Anlegen eines Vakuums. Mit der Enukleation Nadel, drehen Sie die Eizelle bis zum Chromosom-Spindel-Komplex (CSC, die oft als "Kern") ist in der 3-Uhr Position.
- Mit Piezo-Puls dringt der Zona pellucida sorgfältig ohne Beschädigung der Eizelle. Legen Sie die Öffnung der Nadel neben der Metaphase-II Spindel und Vakuum anlegen. Der "Kern" sollte langsam in die Nadel zu bewegen, und die Membran sollte sich Dichtung, wenn es vollständig entfernt wird.
- Übertragen Sie die entkernte Eizellen zurück in die KSOM-AA Tropfen, und waschen Sie sie mehrere Male. Wiederholen Sie die eKeimbildung Schritte mit einer neuen Gruppe von Oozyten. Fort, bis alle Eier entkernt werden oder bis zu 11AM.
- Nuclear Transfer
- Für den Kerntransfer, Austausch der Enukleation Nadel (7 um) mit einem Kerntransfer Nadel (4 oder 5 um) und waschen Sie es mit PVP.
- Legen Sie Ihre Zellen von Interesse (zB CD8 + T-Zellen) in einen Tropfen mit PVP, gut mischen und Inkubation für mindestens 10 min.
- Legen Sie eine Gruppe von entkernte Eizellen (10-30) in einen Tropfen HCZB mit Cytochalasin B (2,5 pg / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up Eizellen horizontal mit dem Kerntransfer Nadel.
- Pick-up ein Donor-Zelle aus dem PVP-Zell-Suspension und saugen es in-and-out, bis die äußere Membran hat sich (Fragmente der Membran und Cytosol sichtbar sein soll) gebrochen. Bei Bedarf kann ein Piezo-Puls angewendet werden können. Einmal im Zellkern isoliert worden ist, verschieben Sie sie ein wenig in die Nadel, und weiterhin abholen Kerne bis 10-30 haben.
- Bewegen Sie die Tropfen mit den ausgerichteten entkernte Eizellen. Fix eine Eizelle mit dem Betrieb Nadel durch Anlegen von Vakuum. Setzen Sie den Kerntransfer Nadel (die Kerne sollten weg von der Öffnung) angrenzend an die Zona pellucida und gelten Piezo-Puls, bis die Nadel durch die Zona pellucida gegangen ist. Vorsichtig bewegen einen Kern an der Spitze der Nadel, die Nadel in die Eizelle, bis die Spitze der Nadel 2 / 3 im Inneren. Tragen Sie eine kleine Unterdruck, so dass ein wenig von der Eizelle Membran in die Nadel.
- Der nächste Schritt ist sehr kritisch, da es das einzige Mal, wenn die Eizelle ist eigentlich "offen". Tragen Sie einen einzigen Impuls von Piezo, drücken Sie den Kern aus der Nadel durch die Anwendung von Überdruck, vorsichtig wieder die Nadel so, dass die Spitze ist ca. 1 / 3 in die Eizelle, und wenden Sie dann Unterdruck und weiter ziehen Sie die Nadel Siegel der Eizelle. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Eizelle.
- Nachdem alle Eizellen von einer Gruppe einen Kern erhalten haben, werden sie gewaschen und in KSOM-AA Medien kultiviert. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Eizellen.
- Nach der letzten Gruppe hat Kulturen in KSOM-AA wurde für mindestens 30 min, sind die SCNT-Embryonen in Tropfen Ca-freien Aktivierungs-haltigen Medien SrCl2 übertragen.
- Nach 6 Stunden der Aktivierung wird die Menge von Pseudo-Vorkerne (PPN)-positive SCNT-Embryonen bestimmt. Die Embryonen werden dann gewaschen und kultiviert, in KSOM-AA Tropfen für weitere 3,5 Tage, bis sie das Blastozysten-Stadium erreicht haben.
- Drogen oder Chemikalien der Wahl (wie Trichostatin A) kann die Aktivierung und Kulturmedien zugesetzt werden.
3.Derivation von embryonalen Stammzellen
Die SCNT-Blastozysten kann entweder übertragen sie in pseudo-schwangere Frauen (auch als direkte oder Ein-Schritt-Klonen genannt) oder zur Ableitung von embryonalen Stammzellen (auch als indirekte oder Zwei-Schritt-Klonen genannt) werden. Da es viel effizienter, ES-Zellen zu erzeugen, wählen wir die Zwei-Schritt-Verfahren. Im Falle der Wissenschaftler in direkter Klonen interessiert ist, kann der Blastozysten direkt in pseudo-schwangere Frauen übertragen werden, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
Es gibt viele Protokolle beschreiben die Gewinnung von embryonalen Stammzellen. Die hier beschriebene ist eine Standard-Technik, die Feeder-Zellen und fetalem Kälberserum verwendet.
- Der zweite Tag nach dem Kerntransfer, bereiten Sie einen 96-U-Well-Platte für ES-Zell-Ableitung.
- 100 l Gelatine in jedes Well einer 96-U-Well-Platte, für ein Minimum von 10 min inkubieren, und entfernen Sie sie danach.
- Thaw Feeder-Zellen und Zellen in ein entsprechendes Volumen von ESD Medium, zB Feeder-Zellen entspricht einer Fläche von 25 cm 2 werden in 10 mL ESD mittel-und 200 ul der Zellsuspension resuspendiert wird in jede der Gelatine-behandelten hinzugefügt.
- Legen Sie die Platte in einen Inkubator und Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Nach 3,5 Tagen sollte die Embryonen im Blastozysten-Stadium sein.
- Bereiten Sie eine sterile bakterielle Gericht durch Plattieren ein paar Tropfen ES-Zell-Medium und sauren thyrode.
- Die Blastozysten werden zunächst aus der KSOM-AA Tropfen zu Tropfen mit normalem ES-Zell-Medium überführt und zweimal gewaschen.
- Sorgfältig Transfer einer Gruppe von Blastozysten (5-10 Blastozysten) in einem Tropfen sauren thyrode und halten dort, bis der Zona pellucida gelöst hat.
- Die Blastozysten werden dann in einen Tropfen mit ES-Medium überführt, zweimal, und dann in den Feeder-beschichtete 96-U-Well-Platte (eine Blastozyste zu einer gut).
- Die Embryonen werden dann für 5-7 Tage in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 kultiviert, ohne sie zu stören. Dies verleiht dem Embryo Zeit, um einettach der Feeder-Schicht, und ein Auswuchs bilden.
- Bereiten 24-Well-Platten, durch Plattieren Anleger in ESD-Medium in jede Vertiefung, zB resuspendieren ein Äquivalent von 50 cm 2 Feeder in 12 mL ESD Medium, und fügen Sie 500 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung.
- Entfernen Sie vorsichtig die ESD Medium aus dem 96-U-Well-Platte mit den Embryonen, die jeweils gut waschen zweimal mit je 250 ul Hepes (oder PBS), mit 50 ul Trypsin und Inkubation für ca. 5 min bei 37 ° C.
- Pipette nach oben und unten mehrere Male, bis Auswuchs hat außer in einem einzigen-Zell-Suspension, Transfer in eine 24-Well-Platte und bei 37 ° C, 5% CO 2. Gesunken
- Wenn ESC Ableitung erfolgreich war, sollte ESC Kolonien werden nach 7-10 Tagen sichtbar.
4.Blastocyst Injektion
Die Injektion von Blastozysten ist eine Routine-Technik für jede Art von transgenen Mausmodell zu generieren. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Injektion von Blastozysten und die anschließende Überführung in pseudo-schwangere Weibchen gut getimten werden muss.
- Prime weiblichen Mäusen mit PMS und HCG, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Nach HCG-Injektion setzen weibliche Mäuse mit männlichen Mäusen (eine weibliche und eine männliche Maus pro Käfig).
- Am nächsten Tag überprüfen Frauen für Stecker. Dies wird als 0.5dpc (Tage post coitus) gezählt.
- Befruchteten Embryonen werden dann aus dem Eileiter, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben, und kultiviert in KSOM-AA für weitere 3 Tage isoliert.
- Bereiten Sie ES-Zellen am Tag der Blastozyste Injektion (3.5dpc).
- Entfernen Sie Medium aus ES-Zellen, zweimal waschen mit Hepes (oder PBS), fügen Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
- Resuspendieren trypsiniert Zellen mit ES-Medium, Platte in eine Schüssel, und inkubieren für 45-60 min bei 37 ° C, 5% CO 2 in Höhe von Feeder-Zellen (Feeder-Zellen schneller als ES-Zellen haften) zu reduzieren.
- Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Röhrchen und zentrifugieren für 5 min bei 1000rpm.
- Überstand entfernen, resuspendieren Zellpellet in 500 ul ES Medium und speichere sie auf Eis, bis sie benötigt.
- Bereiten Sie den Deckel eines sterilen bakteriellen Gericht durch Ausplattieren Tropfen mit PVP und HCZB.
- Bereiten Sie eine 15 mu m Nadel durch Belastung mit Quecksilber, indem sie in Position und Waschen mit PVP.
- Legen Sie eine Gruppe von Blastozysten (10-30 Blastozysten) in einen Tropfen mit HCZB, und fügen 5-50 ul ES-Zell-Suspension (abhängig von der Konzentration) in einen anderen Tropfen HCZB.
- Pick-up-ES-Zellen (50-100 Zellen) mit der Injektionsnadel.
- Gehen Sie zum Drop mit der Blastozysten. Richten Sie die Blastozysten horizontal und fix man mit der Holding Nadel durch Anlegen von Vakuum.
- Mit der Injektionsnadel wiederum die Blastozyste, bis der inneren Zellmasse (ICM) ist an der 9-Uhr-Position.
- Zeigen Sie mit der Injektionsnadel bei 3 Uhr, stellen Sie sicher, dass es keine ES-Zellen an der Spitze der Nadel, und wenden Piezo-Puls, bis die Injektionsnadel dringt durch die Zona pellucida und die Trophektoderm in die blastocoel.
- Veröffentlichung ein paar ES-Zellen (5-15 Zellen), so dass die ES-Zellen der ICM-Stick. Fort, bis alle Blastozysten einer Gruppe mit ES-Zellen injiziert worden.
- Nach einer Gruppe von Blastozysten fertig ist, waschen Sie sie zweimal in KSOM-AA und bewahren Sie sie in einen Tropfen mit KSOM-AA, bis alle Blastozysten injiziert werden.
5. Embryotransfer
Die Übertragung der Embryonen in pseudo-schwangere Frauen stellt einen chirurgischen Eingriff, die sehr sorgfältig und nach den Richtlinien des Forschers Institut durchgeführt werden muss.
- Betäuben weiblichen Empfängermäuse, rasieren unteren rechten Quadranten und zu desinfizieren.
- Mit einer Schere öffnen Sie die Haut, und trennen Sie das Bauchfell von der Haut.
- Suchen Sie den Eierstock durch das Bauchfell (roter Punkt), und öffnen Sie das Bauchfell in der Nähe des Eierstocks.
- Mit einer Pinzette vorsichtig greifen die Eileiter und ziehen Sie die Gebärmutter.
- Pick-up eine Gruppe von etwa 10 Blastozysten mit einer Kapillare verbunden mit einem Mund pipettieren.
- Fix die Gebärmutter mit einem Pinzette, Punsch eine kleine ganze hinein mit einer kleinen Nadel, und legen Sie die Kapillare mit der Blastozysten in das Lumen des Uterus.
- Nach vorsichtiger Embryonen in die Gebärmutter, und entfernen Sie Ihre Kapillare.
- Drücken Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle.
- Suchen Sie die Kanten des Bauchfells und schließen Sie es mit ein paar Stichen.
- Schließen Sie die Haut der Maus mit ein paar Klammern.
- Für post-operativen Schmerzen, verwalten 5 ug Carprofen pro mg Körpergewicht.
Abbildung 1. Somatic cell nuclearÜbertragung von vordefinierten T-Zellen in B6CF1 Hintergrund. Absolute und relative Anzahl von Embryonen aus CD8 + T-Zellen und embryonale Stammzellen aus Blastozysten gewonnen SCNT generiert.
Abbildung 2. Representative durchflusszytometrische Analyse von chimären Mäusen mit SCNT embryonale Stammzellen injiziert. Tor und Anzahl (Prozent insgesamt CD8 + T-Zellen) zeigt das Vorhandensein von spezifischen CD8 + T-Zellen in chimären Mäusen.
Discussion
Wir haben hier, dass SCNT verwendet werden, um transnuclear Mäuse von T-Zellen mit vordefinierten Spezifität generiert werden gezeigt. Obwohl hier nicht gezeigt, sollte die Technik auch nutzbar sein, um transnuclear Mäuse von B-Zellen mit vordefinierten Spezifität zu generieren.
Eine wichtige Sache zu prüfen, ist die Belastung und das Geschlecht der Maus, die infiziert oder geimpft und verwendet werden, um T-oder B-Zellen von Interesse zu isolieren. Da T-und B-Zellen eine sehr geringe Umprogrammierung Effizienz im Allgemeinen haben, empfehlen wir die Verwendung F1-Hybriden gewünschten Haplotyp. Da der Donor-Zelle bestimmt auch das Geschlecht, empfehlen wir die Verwendung T-oder B-Zellen aus männlichen Mäusen. Dies bedeutet, dass nur männliche chimäre Mäuse würden die TCR-oder BCR durch die Keimbahn übertragen, mit männlichen Mäusen wird einfacher und schneller zu züchten.
Zusammen genommen denken wir, dass epigenetische Reprogrammierung via SCNT stellt ein leistungsfähiges Tool, um eine neue Art von Maus-Modellen, die von großem Vorteil für die immunologische Feld erzeugt.
Disclosures
Ein Patent wurde angemeldet.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar, H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao und G. Yap für fruchtbare Diskussionen und Reagenzien. Wir sind dankbar, J. Dausman, R. Flannery, und J. Jackson für die Unterstützung bei der Verwaltung der Maus Kolonie. Wir sind dankbar, P. Wisniewski für FACSorting. EMF wurde vom Human Frontier Science Program unterstützt. RJ wurde von National Institute of Health gewährt RO1-HD045022 und R37-CA084198 unterstützt. HLP wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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